[發明專利]一種芽囊原蟲絕對熒光定量PCR檢測方法

在審

• 申請號: 202110582517.6
• 申請日: 2021-05-27
• 公開（公告）號: CN113186321A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 菅復春;劉林科;菅憶晨;寧曉冬;張龍現;王榮軍;張素梅
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州匯科專利代理事務所(特殊普通合伙) 41147
• 代理人: 孫力文

本發明公開了一種芽囊原蟲絕對熒光定量PCR檢測方法，屬于分子生物學技術領域，該芽囊原蟲絕對熒光定量PCR檢測方法包括下列步驟：芽囊原蟲病原基因組DNA的提取；引物的設計與合成；絕對熒光定量PCR方法的建立；標準曲線的繪制；絕對熒光定量PCR方法的靈敏度和特異性試驗。本發明建立了快速，靈敏的芽囊原蟲分子檢測方法，針對芽囊原蟲SSU rDNA位點設計引物，在熒光定量PCR儀中約1 h即可高效擴增出結果。與傳統的PCR檢測方法相比，具有省時、高效、靈敏、定量的特點。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種芽囊原蟲絕對熒光定量PCR檢測方法。

背景技術

芽囊原蟲(Blastocystis spp. )屬于芽囊原蟲目，芽囊原蟲科，芽囊原蟲屬，是一類寄生于宿主腸道的具有多態性的厭氧單細胞原生生物，芽囊原蟲具有廣泛的遺傳多樣性，迄今為止，根據SSU rDNA序列的多態性進行基因亞型分類，已在人類和動物中發現了22種不同亞型（Subtypes，STs），包括ST1～ST17、ST21和ST23～ST26，其中10個芽囊原蟲亞型（ST1～ST9和ST12）具有人獸共患性，其余亞型目前只在動物體內被檢測到。此外也有未知基因亞型的相關報道。

目前，芽囊原蟲的主要檢測方法有病原學診斷法、血清學診斷法、分子生物學診斷法和體外培養診斷法。

病原學診斷主要有糞便涂片檢查和體外培養試驗。糞便涂片檢查是芽囊原蟲檢查最為經典的方法，其要求采集人或動物的新鮮糞便做涂片，或輔以盧戈氏碘液染色法染色，染色后在400倍鏡下觀察結果。該法雖然簡單可靠，但在感染

強度小時很難在顯微鏡下檢查出病原，而且操練的熟練程度將直接影響診斷結果的準確性。體外培養試驗是在感染強度很小時，將糞便樣本置于培養基中，以使芽囊原蟲得到增殖，進而提高檢測效率與靈敏性，但此方法耗時長且繁瑣。因此體外培養法不適于田間流行病學調查，而較適于病原的實驗室分離（王沛, 張富強, 何波, 等. 人芽囊原蟲體外培養研究進展[J]. 中國熱帶醫學, 2020, 20(12): 1207-1211.）。

血清學診斷主要有間接免疫熒光抗體試驗(indirect fluorescent antibody ,IFA)及酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）。蘇水蓮等人采用硝酸纖維素膜作為同相載體，用人芽囊原蟲可溶性抗原作包被抗原，辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體(HRP-IgG)作酶標抗體，初步建立檢

測人芽囊原蟲血清抗體的Dot -ELISA診斷方法，用該方法分別對體外培養法陽性者和陰性者血清進行檢測，敏感度為92.13%，特異度為97.92%，表明Dot -ELISA用于檢測人芽囊原蟲血清抗體較敏感、特異。（蘇水蓮, 嚴宜明, 廖華, 等. Dot-ELISA檢測人芽囊原蟲血清抗體的研究[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2007(03): 256-258.）。Lanuza MD等人采樣間接免疫熒光法測定61株芽囊原蟲分離株，結果顯示除1, 2組存在差異，其余分離株血清學檢測結果均一致，這也表明血清學分析方法也可作為B.h分型的佐證（Lanuza MD, Carbajal J A, Villar J, et al. Soluble-protein and antigenic heterogeneityin axenic Blastocystis hominis isolates: pathogenic implications[J].Parasitol Res, 1999, 85: 93-7.）。