[發(fā)明專利]一種包涵體的復(fù)性方法及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110580007.5
• 申請(qǐng)日: 2021-05-26
• 公開（公告）號(hào): CN113136407A
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柯紅;熊志怡;張偉;豐毅;周贏;易汪雪;張振
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/00
• 分類號(hào): C12P21/00;C07K14/705;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;G01N33/68;C12R1/19
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 丁倩

本發(fā)明公開了一種包涵體的復(fù)性方法及試劑盒，所述方法包括：誘導(dǎo)目的蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)，然后裂解宿主細(xì)胞獲得目的蛋白；溶解目的蛋白；采用鎳柱層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，用包含十二烷基肌氨酸鈉和咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行梯度洗脫；收集包含目的蛋白的洗脫液裝入透析袋中，并放入組分為Tris?HCl和EDTA的復(fù)性緩沖液對(duì)目的蛋白透析復(fù)性，得到復(fù)性蛋白。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有的包涵體復(fù)性方法操作復(fù)雜不易控制，成本高，得率低，活性差等問題，通過對(duì)洗脫緩沖液和復(fù)性緩沖液進(jìn)行優(yōu)化，使其發(fā)揮協(xié)同作用，有效提升了包涵體的復(fù)性效果，提高了目的蛋白的純度及活性，并且該方法操作簡單，成本低，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種包涵體的復(fù)性方法及試劑盒。

背景技術(shù)

大腸桿菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)以其基因背景清楚，易于培養(yǎng)和控制，轉(zhuǎn)化操作簡單，表達(dá)水平高，成本低，周期短，表達(dá)效率高等，成為科研者研究重組蛋白質(zhì)的重要工具。但外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌高效表達(dá)時(shí)，往往形成不可溶、無生物活性的包涵體。包涵體必須經(jīng)過變性到復(fù)性的過程，才能獲得結(jié)構(gòu)正確有活動(dòng)的蛋白質(zhì)。目前廣泛采用的復(fù)性方法有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性和柱上復(fù)性，稀釋復(fù)性是用緩沖液快速稀釋溶解包涵體蛋白質(zhì)，達(dá)到降低變性劑濃度的目的，但會(huì)被稀釋到很低濃度增加蛋白體積同時(shí)變性劑稀釋速度太快不易控制；柱上復(fù)性成本較高，同時(shí)體積受限；透析復(fù)性通過逐漸降低外透析液濃度來控制變性劑去除速度，不會(huì)增加太多體積，易于控制，適合少量蛋白復(fù)性方法的摸索。每種復(fù)性方法都有其特殊性。目前的包涵體復(fù)性方法得率相對(duì)較低，因此通過高效簡單的復(fù)性方法，獲得高純度高活性的蛋白質(zhì)尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有的包涵體復(fù)性方法存在操作復(fù)雜不易控制，成本高，獲得的蛋白質(zhì)得率低，活性差等技術(shù)問題，提供了一種包涵體的復(fù)性方法，通過對(duì)洗脫緩沖液和復(fù)性緩沖液的組分選取進(jìn)行優(yōu)化，將傳統(tǒng)洗脫緩沖液中的高濃度尿素?fù)Q成低濃度的十二烷基肌氨酸鈉，并在復(fù)性緩沖液中省略了傳統(tǒng)的濃度梯度變化的尿素，有效提升了包涵體的復(fù)性效果，提高了目的蛋白的純度和活性，并且該方法操作簡單，成本低，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供了一種包涵體的復(fù)性方法，所述方法包括：

步驟1、誘導(dǎo)目的蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)，然后裂解宿主細(xì)胞獲得目的蛋白；

步驟2、溶解目的蛋白；

步驟3、采用鎳柱層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，加入包含十二烷基肌氨酸鈉和咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行梯度洗脫；

步驟4、收集包含目的蛋白的洗脫液裝入透析袋中，并放入組分為Tris-HCl和EDTA的復(fù)性緩沖液對(duì)目的蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，得到復(fù)性蛋白。

進(jìn)一步的，步驟3中所述洗脫緩沖液包括：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1～1％十二烷基肌氨酸鈉，濃度20～500mM咪唑。

進(jìn)一步的，步驟4中所述復(fù)性緩沖液包括：5～100mM Tris-HCl和0.5～2mM EDTA。

進(jìn)一步的，步驟1中所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞大腸桿菌。

進(jìn)一步的，步驟1中采用超聲破碎裂解宿主細(xì)胞，然后離心取沉淀獲得目的蛋白。

進(jìn)一步的，步驟2中使用包含8M尿素的溶解緩沖液對(duì)目的蛋白進(jìn)行溶解。

進(jìn)一步的，所述方法還包括：步驟4中收集包含目的蛋白的洗脫液后，向其中加入50～200mM精氨酸、0.2～1mM氧化性谷胱甘肽，1～10mM還原性谷胱甘肽。

進(jìn)一步的，所述方法還包括：對(duì)目的蛋白復(fù)性后，驗(yàn)證復(fù)性蛋白的活性。

進(jìn)一步的，采用ELISA檢測復(fù)性蛋白活性，包括：稀釋復(fù)性蛋白，使復(fù)性蛋白包被對(duì)應(yīng)抗原并封閉，依次用多抗抗體孵育、二抗孵育，然后加入顯色液，于酶標(biāo)儀中測定復(fù)性蛋白的活性。