[發(fā)明專(zhuān)利]一種三聯(lián)培養(yǎng)基序貫培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110579979.2
• 申請(qǐng)日: 2021-05-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113201490A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張俊河;董衛(wèi)華;王天云;張繼紅;馬靜;楊雯雯;肖云喜;楊獻(xiàn)軍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛(ài)周

1.一種三聯(lián)培養(yǎng)基序貫培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)分離華通氏膠；

2)將華通氏膠組織塊經(jīng)生理鹽水洗滌后剪成1～2mm³大小，使其均勻鋪于明膠預(yù)先包被的培養(yǎng)皿中，37℃放置2h后，加入第一培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)過(guò)程中，在組織塊上面放置無(wú)菌的蓋玻片以促進(jìn)組織塊貼壁和間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)；所述第一培養(yǎng)基主要由DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素組成，其中胎牛血清體積占比為7.5-15％；

3)待第一培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，改用第二培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)；所述第二培養(yǎng)基主要由DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素和間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)添加物組成，其中胎牛血清體積占比為7.5-15％，間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)添加物體積占比為0.1-0.3％；

4)傳代兩次后，后續(xù)重新?lián)Q回第一培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中分離華通氏膠包括如下步驟：無(wú)菌條件下獲得胎兒的臍帶組織，無(wú)菌生理鹽水清洗并棄去血管變形處以及開(kāi)口兩端，撕開(kāi)臍帶，用組織鑷剔除兩條動(dòng)脈、一條靜脈和臍帶外膜，留下內(nèi)膜，內(nèi)膜即為華通氏膠。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述臍帶取自正常足月剖宮產(chǎn)胎兒。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中加入第一培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，前3天靜置培養(yǎng)，第4天補(bǔ)加第一培養(yǎng)基3～4ml，觀察生長(zhǎng)情況，之后每2～3天換液一次，待大部分組織快均有細(xì)胞爬出時(shí)，去掉組織塊，換液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中明膠預(yù)先包被的培養(yǎng)皿，明膠包被條件為4℃過(guò)夜。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中待第一培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定是指：用第一培養(yǎng)基對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70～80％。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培養(yǎng)基、第二培養(yǎng)基中抗生素的含量為：100-150U/mL青霉素、100-150μg/mL鏈霉素和0.25-0.75μg/mL兩性霉素B。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)至4)中所述培養(yǎng)為在37℃、5％CO₂環(huán)境中培養(yǎng)。