[發明專利]檢測具有感染性SARS-CoV-2的PCR靶序列、引物和探針及應用

有效

• 申請號: 202110578905.7
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113151608B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 金梅林;高朔;鄒維華;鄒忠;楊麗;呂長杰;回顯峰;孫小美
• 申請（專利權）人: 華中農業大學;武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明涉及SARS?CoV?2核酸檢測領域，更具體地，涉及檢測具有感染性SARS?CoV?2的PCR靶序列、引物和探針及應用。本發明提供的檢測具有感染性SARS?CoV?2的PCR靶序列、引物和探針可以很好的區分SARS?CoV?2的感染性，同時具有靈敏度高、重復性好的特點。與常規感染性SARS?CoV?2檢測試驗相比，本發明極大縮短了感染性SARS?CoV?2檢測的試驗周期，降低了對科研條件和設備的要求；有效區分了病毒衣殼蛋白損傷導致病毒失活的核酸與和感染性病毒粒子，提高了檢測的準確性，減少了實際檢測中出現的假陽性現象。

技術領域

本發明涉及SARS-CoV-2核酸檢測領域，更具體地，涉及檢測具有感染性SARS-CoV-2的PCR靶序列、引物和探針及應用。

背景技術

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratorysyndromecoronavirus 2,SAR S-CoV-2，簡稱新型冠狀病毒)感染的肺炎(Corona VirusDisease 2019，簡稱COVID-19)，簡稱新冠肺炎，是經呼吸道傳播的一種傳染病。

當前，新型冠狀病毒核酸檢測是確診新冠肺炎、篩查無癥狀感染者、調查冷鏈食品和環境污染的金標準，是疫情防控的關鍵點。目前對新型冠狀病毒的核酸檢測手段主要是qRT-PCR法，此方法以其較高的特異性及敏感性在新型冠狀病毒檢測方面發揮著重大作用。但該方法只能檢測樣本中是否存在病毒的核酸序列，對于樣本中的病毒是否具有衣殼蛋白完整性和感染性等均不能給出有效提示。目前國內外報道了大量在醫院門把手、空氣、冷鏈運輸等場所中出現新型冠狀病毒檢測核酸陽性事件。更加細致的研究發現，這些核酸檢測陽性大多是由于這些場所已進行高溫、消毒劑等滅活措施而產生的“假陽性”。對于新型冠狀病毒使用熱滅活、消毒劑消殺等滅活措施后樣本中的病毒是否仍具有感染性，還需要用經典的病毒培養分離方法確定。由于新型冠狀病毒為新發高致病性病原體，常規傳統培養及血清學等臨床常用方法需在具有生物安全防護條件下的P3級實驗室內進行且很難在較短時間內去檢測病原體，這使得通過分離培養來進行新型冠狀病毒的感染性檢測對于基層單位或冷鏈運輸場所不具有可行性，給新型冠狀病毒的實際防控，如確定感染途徑，醫院、冷鏈運輸等場所經過消毒處理后環境中是否還有感染性病毒等，帶來了極大的不便。因此，現急需發展一種檢測感染性新型冠狀病毒快速簡便的替代技術。

疊氮溴化丙錠(PMA)是一種對DNA或RNA具有高度親和力的光敏核酸染料，PMA不能穿透完整的病毒衣殼蛋白，只能選擇性地結合病毒衣殼蛋白受損后所暴露出來的核酸。病毒衣殼蛋白的完整性是判斷病毒活性的一個標志，日常工業生產、醫院、實驗室和冷鏈運輸等環境大多使用高溫滅活或化學消毒劑滅活等方式進行消毒殺菌，這些滅活方法及化學制劑主要通過破壞病毒衣殼蛋白結構的方式使病毒失活。PMA能夠穿透受損的病毒衣殼蛋白與病毒核酸結合，在一定條件下孵育、光解后，PMA會和暴露的核酸穩定交聯使核酸無法進行后續的PCR反應，從而去除失活病毒暴露的核酸所引起的干擾(假陽性)，達到檢測樣本中是否含有感染性病毒的目的。另外，低濃度的非離子表面活性劑Triton X-100可作為PMA預處理的增強劑，通過選擇性降低失活病毒受損衣殼蛋白的通透性，使暴露出的核酸與更多的PMA結合，提高PMA檢測感染性病毒假陽性的能力。