[發(fā)明專(zhuān)利]一種口腔鱗癌類(lèi)器官培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110578542.7
• 申請(qǐng)日: 2021-05-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113278588A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章茜;王育新;胡勤剛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京市口腔醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/09
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/09
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 劉珊珊

本發(fā)明公開(kāi)了一種口腔鱗癌類(lèi)器官的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：S1、解離酶配置；S2、配置培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12、R?spondin1條件培養(yǎng)基、Wnt3A條件培養(yǎng)基、無(wú)菌水和功能組分組成；S3、臨床操作獲取樣品，通過(guò)取材或手術(shù)切除獲得腫瘤標(biāo)本，切取組織，用無(wú)菌生理鹽水沖洗3次，將組織放入DMEM培養(yǎng)基中浸泡1小時(shí)，繼續(xù)解離；S4、組織預(yù)處理：將步驟S3中獲得的樣品置于無(wú)菌6孔板中，用一次性無(wú)菌手術(shù)刀片將樣品組織塊切碎；S5、組織解離消化：加入步驟S1中配好的解離酶，重復(fù)離心?去除上清這一過(guò)程3次以充分去除解離酶，最后一次離心前將細(xì)胞與樣品組織塊混合；S6、類(lèi)器官培養(yǎng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種口腔鱗癌類(lèi)器官培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，2020年全球OSCC年新發(fā)病例約37.77萬(wàn)，死亡17.78萬(wàn)，其5年生存率僅60％左右。對(duì)于中晚期尤其是復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性的OSCC患者，化療輔助下的綜合治療是標(biāo)準(zhǔn)化的治療方案，例如順鉑和紫杉醇是一線(xiàn)化療用藥，但治療效果并不盡如人意，而靶向治療藥物對(duì)OSCC的治療效果也有待進(jìn)一步驗(yàn)證，因此，目前急需開(kāi)發(fā)出更為有效的個(gè)體化精準(zhǔn)治療方案。

同時(shí)，腫瘤類(lèi)器官(tumor organoid)模型能夠很好地預(yù)測(cè)原位腫瘤的藥物敏感性；類(lèi)器官(organoid)是一種能夠自發(fā)組織、3D培養(yǎng)的體外細(xì)胞模型；類(lèi)器官能夠模擬體內(nèi)器官的微觀結(jié)構(gòu)和功能，類(lèi)器官由多能干細(xì)胞或成體干細(xì)胞在多種復(fù)雜的細(xì)胞因子誘導(dǎo)下發(fā)育而來(lái)；腫瘤類(lèi)器官，是利用體外培養(yǎng)類(lèi)器官的方法來(lái)培養(yǎng)原代腫瘤細(xì)胞；腫瘤類(lèi)器官能夠維持腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)的形態(tài)，其基因表達(dá)譜與體內(nèi)腫瘤相似性約90％；腫瘤類(lèi)器官不僅能夠保留原發(fā)腫瘤的特點(diǎn)，保持不同病人腫瘤之間的差異性，而且能夠保持同一個(gè)病人原發(fā)腫瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。此外，腫瘤類(lèi)器官還能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)原發(fā)腫瘤的藥物敏感性，為未來(lái)個(gè)體化治療提供參考。更重要的是，腫瘤類(lèi)器官的建立只需一周時(shí)間，藥物敏感性實(shí)驗(yàn)也僅需10天，具有極強(qiáng)的臨床時(shí)效性，是未來(lái)進(jìn)行腫瘤臨床藥物篩選的最佳選擇。

然而，口腔鱗癌與其他腫瘤相比培養(yǎng)難度在于，一方面口腔鱗癌處于帶菌環(huán)境，類(lèi)器官出現(xiàn)細(xì)菌、支原體乃至真菌污染的風(fēng)險(xiǎn)較高；另一方面口腔鱗癌病理類(lèi)型以中高分化為主，高分化腫瘤細(xì)胞角化程度較好，腫瘤干性較低，構(gòu)建類(lèi)器官對(duì)比其他低分化腫瘤存在更高難度，口腔鱗癌類(lèi)器官生長(zhǎng)緩慢且培養(yǎng)成功率較低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種口腔鱗癌類(lèi)器官培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中口腔鱗癌類(lèi)器官培養(yǎng)中污染比例較高、培養(yǎng)成功率低及生長(zhǎng)緩慢的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明提供了一種口腔鱗癌類(lèi)器官培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12、R-spondin1條件培養(yǎng)基、Wnt3A條件培養(yǎng)基、無(wú)菌水和功能組分組成，所述功能組分在該類(lèi)器官培養(yǎng)基中的終濃度組成為：HEPES，8-12mmol/L；Glutamax 0.8-1.2×；A83-01，400-600nmol/L；EGF，35-60ng/mL；Noggin，80-120ng/mL；FGF10，8-12ng/mL；Gastrin I，0.01μmol/L；N-acetylcysteine，1-1.5mmol/L；nicotinamide，8-12mmol/L；PGE2，0.8-1.2μmol/L；Butylated hydroxyanisole，4-10ng/ml；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液0.8-1.2X；B27 supplement；Prostaglandin E2，0.8-1.2umol/L；且R-spondin1條件培養(yǎng)基占總體積的10％，Wnt3A條件培養(yǎng)基占總體積的50％