[發(fā)明專利]一種Cas12a變體及其在基因編輯中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110578385.X
• 申請(qǐng)日: 2021-05-26
• 公開（公告）號(hào): CN113136376B
• 公開（公告）日: 2022-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 殷雷;周進(jìn);陳鵬;王宏建;劉歡;方嘉凌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/22
• 分類號(hào): C12N9/22;C12N15/113;C12N15/861;C12N15/867;C12N5/10;C12N7/01
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 江慧

本發(fā)明提供了一種Cas12a變體及其在基因編輯中的應(yīng)用，所述Cas12a變體包括如下中的至少一種：Lb2Cas12a?K518R，氨基酸序列分別如SED ID NO.1所示；LbCas12a?K538R，氨基酸序列分別如SED ID NO.2所示；AsCas12a?K548R，氨基酸序列分別如SED ID NO.3所示。本發(fā)明首次通過(guò)蛋白改造，獲得Cas12a變體，使Cas12a的PAM識(shí)別相比較對(duì)應(yīng)野生型更嚴(yán)格，從而降低脫靶效應(yīng)；所述三種Cas12a變體能夠在crRNA的介導(dǎo)下定點(diǎn)對(duì)真核生物基因組進(jìn)行基因編輯且具有更低的脫靶效應(yīng)，三種Cas12a變體的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步擴(kuò)大了基因編輯工具的種類。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種Cas12a變體及其在基因編輯中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

自2013年以來(lái)，基因編輯技術(shù)取得了突破性進(jìn)展，此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在基礎(chǔ)科學(xué)研究、醫(yī)藥、臨床、生物技術(shù)等許多領(lǐng)域引起了新的變革。除了具有代表性的Cas9系統(tǒng)之外，Cas12，又名Cpf1，作為又一種被發(fā)現(xiàn)的具有基因編輯效應(yīng)的CRISPR系統(tǒng)新成員，極大的擴(kuò)大了基因編輯系統(tǒng)靶點(diǎn)的可編輯范圍，相比于Cas9系統(tǒng)，Cas12a所具有的加工前提RNA的功能，為其介導(dǎo)多基因編輯提供了相比與Cas9系統(tǒng)更為便捷高效的編輯能力。除此之外，相比于Cas9的向?qū)NA，Cas12a的向?qū)NA組成更為簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)更為方便。

2015年，張峰團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)了Cas9系統(tǒng)之外的另外一種具有基因編輯能力的新成員，Cas12a，又名Cpf1，將其劃分到CRISPR系統(tǒng)2類V型中。相比于Cas9系統(tǒng)，Cas12a的編輯效率與Cas9的效率相當(dāng)，在有些靶點(diǎn)低于Cas9。Cas12a的脫靶率極低，相比于Cas9脫靶率高的特性，Cas12a是一種安全的基因編輯工具。Cas12a在切割之后形成粘性末端，而Cas9形成平末端，已有研究表明，Cas12a切割之后的粘性末端相比于Cas9的平末端而言，更容易發(fā)生同源重組修復(fù)，這也為基因的定點(diǎn)插入和修復(fù)提供了更好的工具。在向?qū)NA的加工方面，Cas12a具有明顯的優(yōu)勢(shì)，僅僅只需要Cas12a本身就能夠完成對(duì)前提RNA的加工，而Cas9系統(tǒng)則需要RNaseIII的加工，這極大地促進(jìn)Cas12a在多基因編輯上的應(yīng)用。在PAM的識(shí)別上，Cas12a識(shí)別5’-TTTN-3’或5’-KYTV-3’，Cas9則識(shí)別5’-NGG-3’。

因此，Cas12a作為一種新型基因編輯工具，與Cas9系統(tǒng)一道，為科學(xué)研究和疾病的治療提供了有力的工具。基于對(duì)目前已有的Cas12a的研究，為應(yīng)對(duì)將來(lái)各種情況下的基因編輯事件，發(fā)現(xiàn)更多的具有一定特性的Cas12a變體是一件具有重要意義的事情。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種Cas12a變體及其在基因編輯中的應(yīng)用，該Cas12a變體包括Lb2Cas12a-K518R，LbCas12a-K538R，AsCas12a-K548R，其在體外比對(duì)應(yīng)野生型PAM識(shí)別更嚴(yán)格；且在體內(nèi)脫靶效應(yīng)更低。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種Cas12a變體，所述Cas12a變體包括如下中的至少一種：

Lb2Cas12a-K518R，氨基酸序列分別如SED ID NO.1所示；

LbCas12a-K538R，氨基酸序列分別如SED ID NO.2所示；

AsCas12a-K548R，氨基酸序列分別如SED ID NO.3所示。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種重組表達(dá)載體，所述重組載體表達(dá)所述的Cas12a變體。

進(jìn)一步地，所述重組表達(dá)載體包括質(zhì)粒載體、病毒載體和噬菌體載體中的一種。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種重組菌或重組細(xì)胞系或重組病毒，包含所述的重組表達(dá)載體。