[發明專利]用疏水蛋白膜作為支持膜的電鏡載網及其制備方法有效
| 申請號： | 202110576212.4 | 申請日： | 2021-05-26 |
| 公開（公告）號： | CN113267520B | 公開（公告）日： | 2023-03-24 |
| 發明（設計）人： | 范宏成;孫飛;喬明強;王波;朱赟 | 申請（專利權）人： | 中國科學院生物物理研究所;南開大學 |
| 主分類號： | G01N23/04 | 分類號： | G01N23/04;G01N23/20008;G01N1/42;H01J37/20;C07K14/00;C07K1/14;C07K1/34;C12N15/81 |
| 代理公司： | 北京中強智尚知識產權代理有限公司 11448 | 代理人： | 呂夢雪 |
| 地址： | 100101*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 疏水 蛋白 作為 支持 電鏡載網 及其 制備 方法 | ||
1.一種用疏水蛋白膜作為支持膜的電鏡載網，其特征在于：所述電鏡載網包括設置在常規電鏡載網表面作為支持膜的疏水蛋白膜，所述疏水蛋白為重組表達制備的疏水蛋白。
2.一種權利要求1所述的用疏水蛋白膜作為支持膜的電鏡載網的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
將疏水蛋白溶液滴到具有疏水性質的基質上，靜置至液滴表面形成疏水蛋白膜；
取電鏡載網置于液滴表面，使電鏡載網與疏水蛋白膜接觸，孵育5分鐘以上至疏水蛋白膜鋪在電鏡載網上；
除去鋪有疏水蛋白膜的電鏡載網上的多余液體；
將鋪有疏水蛋白膜的電鏡載網滴加純水潤洗；
將潤洗后的電鏡載網自然干燥，制得電鏡載網；
制得的電鏡載網可用于多種蛋白的冷凍電鏡樣品制備和高分辨率結構解析。
3.根據權利要求2所述的用疏水蛋白膜作為支持膜的電鏡載網的制備方法，其特征在于：所述電鏡載網為Quantifoil載網、GIG載網、 NiTi合金載網或石墨烯載網。
4.根據權利要求2所述的用疏水蛋白膜作為支持膜的電鏡載網的制備方法，其特征在于：所述疏水蛋白溶液的濃度為1~1000μg/mL。
5.根據權利要求4所述的用疏水蛋白膜作為支持膜的電鏡載網的制備方法，其特征在于：所述疏水蛋白溶液中的疏水蛋白為所有種類的疏水蛋白或經改造后的疏水蛋白。
6.根據權利要求5所述的用疏水蛋白膜作為支持膜的電鏡載網的制備方法，其特征在于，所述疏水蛋白溶液的配制方法包括如下步驟：
將線性化的質粒pPIC9-
選擇陽性轉化子進行搖瓶發酵和誘導表達；
通過中空纖維柱超濾和乙腈抽提兩步法純化疏水蛋白；
將疏水蛋白凍干成疏水蛋白粉末；
將疏水蛋白粉末溶解在溶劑中并超聲振蕩，制成疏水蛋白溶液；
將疏水蛋白溶液稀釋并超聲振蕩得到濃度為1~1000μg/mL的疏水蛋白溶液。
7.根據權利要求6所述的用疏水蛋白膜作為支持膜的電鏡載網的制備方法，其特征在于：所述溶劑為超純水、PBS緩沖劑、Tris緩沖劑或HEPES緩沖劑。
8.根據權利要求2所述的用疏水蛋白膜作為支持膜的電鏡載網的制備方法，其特征在于：所述疏水蛋白溶液滴到具有疏水性質的基質上的體積為10-500 μL。
9.根據權利要求8所述的用疏水蛋白膜作為支持膜的電鏡載網的制備方法，其特征在于：所述基質為封口膜或玻片。
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