[發明專利]一種基于RT-RPA方法的微量核酸釋放劑、其制備方法及應用

在審

• 申請號: 202110574667.2
• 申請日: 2021-05-26
• 公開（公告）號: CN113337500A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 常宇桐;胡孔新;劉麗娟;張麗萍;楊爽
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 楊永莉

本發明涉及一種基于RT?RPA方法的微量核酸釋放劑，其包括TritonX?100、Tween?20、異硫氰酸胍、乙醇、異戊醇和水。本發明提供的微量核酸釋放劑，所需的原料價錢便宜，易于獲得，且對身體無害。該微量核酸釋放劑可快速破壞病原體外殼蛋白結構，釋放核酸，可大大縮短核酸提取純化的時間，無需復雜的操作步驟，操作簡便。本發明的微量核酸釋放劑所需樣本量少，可對微量珍貴樣本進行檢測。本發明的微量核酸釋放劑可以直接對血清、全血、血漿、咽拭子、糞便等樣本核酸進行提取，無需加熱，離心等復雜步驟，只需要一步加樣過程，30分鐘內即可完成核酸的提取和釋放過程。

技術領域

本發明涉及一種基于RT-RPA方法的微量核酸釋放劑、其制備方法及應用，屬于生物試劑技術領域。

背景技術

核酸提取技術是分子生物學研究的基礎，現已廣泛應用于病原微生物檢測、環境微生物檢測、食品安全檢測等領域。傳統的核酸提取物理方法有煮沸法、磁珠法、超聲波法等；化學方法有表面活性劑、堿裂解法等；生物方法主要有酶法等。目前，提取核酸釋放劑存在的主要問題有細胞裂解不完全，造成核酸釋放不徹底，所得核酸不穩定尤其是RNA，受溫度、酶等因素易降解；細胞內蛋白含量較高，且含有大量抑制核酸檢測的物質，造成提取試劑與檢測體系不匹配，因此還需要采用傳統方法利用多步驟、多種不同試劑等來去除PCR反應的抑制劑。

RT-RPA是與熒光定量PCR最為相似的檢測技術，該方法具有較高的靈敏度及特異性，但是其沒有一個成熟的引物探針篩選規則，只能通過設計和篩選大量的引物探針，形成靈敏度高、特異性強的檢測試劑。微量核酸釋放劑與PCR相結合的檢測方法報道較多，但目前未見微量核酸釋放劑與RT-RPA方法相結合檢測病原微生物的文獻報道。

目前核酸提取技術迅猛發展，但仍存在一些缺點，比如，苯酚氯仿抽提法雖然采用了實驗室常見的試劑，做起來成本比較低廉。但是使用了苯酚、氯仿等試劑，毒性較大，長時間操作對人員健康有較大影響，且需要反復抽提，核酸的回收率較低，損失量較大。磁珠法雖安全無毒，但是成本較高。離心柱法雖有利于RNA保護，但需要較多的樣本，耗材多，且需反復離心，不便于高通量、自動化操作。

傳統的PCR方法所需的時間較長，需要變性、退火、延伸等多個步驟，通常1-2小時才能完成核酸檢測。如何能快速實現核酸有效提取，是亟需解決的技術問題。

發明內容

(一)要解決的技術問題

為了解決現有技術的上述問題，本發明提供一種基于RT-RPA方法的微量核酸釋放劑、其制備方法及應用，其與RT-RPA的檢測方法相結合，對(血清、血漿、糞便等)樣本實現進行快速、靈敏的檢測目的。

(二)技術方案

為了達到上述目的，本發明采用的主要技術方案包括：

一種基于RT-RPA方法的微量核酸釋放劑，其包括Triton X-100、Tween-20、異硫氰酸胍、乙醇、異戊醇和水。

如上所述的微量核酸釋放劑，優選地，所述Triton X-100按體積百分比占0.03～10％，所述Tween-20按體積百分比占0.03～10％，所述乙醇按體積百分比占10～30％，異戊醇按體積百分比占15～25％，余量體積為無酶無菌水，所述異硫氰酸胍的終濃度為40～80mmol/L。

如上所述的微量核酸釋放劑，優選地，所述Triton X-100按體積百分比占0.05％，所述Tween-20按體積百分比占0.05％，所述乙醇按體積百分比占25％，異戊醇按體積百分比占20％，余量體積為無酶無菌水，所述異硫氰酸胍的終濃度為50mmol/L。