[發(fā)明專利]一種海藻糖轉(zhuǎn)化率提高的麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110573135.7
• 申請日: 2021-05-25
• 公開（公告）號: CN113308446B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳敬;宿玲恰;陳春;夏偉
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12P19/12;C12P19/14;C12P19/16;C12P19/18
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發(fā)明公開了一種海藻糖轉(zhuǎn)化率提高的麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體是通過將麥芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸第47位點進(jìn)行突變，得到了與親本麥芽寡糖基海藻糖合成酶海藻糖轉(zhuǎn)化率更高的突變體。本發(fā)明的麥芽寡糖基海藻糖合成酶S47P、S47Q、S47D、S47V、S47L、S47N和S47A的海藻糖轉(zhuǎn)化率得到提高，相對野生型分別提高0.9％、1.0％、1.6％、2.1％、3.3％、6.0％和8.0％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種海藻糖轉(zhuǎn)化率提高的麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

海藻糖(Trehalose)是一種自然界中廣泛存在的二糖，由兩個葡萄糖通過α,α-1,1-糖苷鍵連接而成，因為其獨特的高保濕性，熱酸穩(wěn)定性和安全性，被廣泛應(yīng)用于食品，農(nóng)業(yè)，醫(yī)藥，化妝品。從20世紀(jì)80年代開始，各國相繼開展了海藻糖生理生化和分子生物學(xué)的研究，該糖現(xiàn)已成為國際上最近開發(fā)的主要低聚糖之一。

目前，生產(chǎn)海藻糖的方法主要有三種，分別是酸化酶法、海藻糖合酶單酶法、MTSase和MTHase雙酶法。其中，MTSase和MTHase雙酶法采用液化后的淀粉作為底物，兩個酶協(xié)同反應(yīng)，生產(chǎn)海藻糖，該方法生產(chǎn)海藻糖的轉(zhuǎn)化率較高，副產(chǎn)物較少，并用廉價的淀粉作為底物，降低了成本，因而得到了廣泛的應(yīng)用。

在應(yīng)用MTSase和MTHase雙酶法制備海藻糖的過程中，淀粉經(jīng)過高溫液化后加入支鏈淀粉酶作用生成麥芽糊精；麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)作用于底物還原性末端的α,α-1,4-糖苷，產(chǎn)生α,α-1,1-糖苷鍵的分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷作用，形成中間產(chǎn)物麥芽寡糖基海藻糖；麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTHase)則專一的內(nèi)切該中間產(chǎn)物中麥芽寡糖基與海藻糖相連的α,α-1,4-糖苷鍵，使之分解產(chǎn)生海藻糖和減少兩個葡萄糖單位的新麥芽寡糖，減少兩個葡萄糖單位的新麥芽寡糖作為新底物進(jìn)行下一輪反應(yīng)，如此反復(fù)交替進(jìn)行兩種酶反應(yīng)就可以將麥芽寡糖轉(zhuǎn)化成主要為海藻糖，以及少量葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖的產(chǎn)物。

工業(yè)上，碎米加工制備大米蛋白粉后會產(chǎn)生大量的淀粉液化液，剩余的液化液可以作為生產(chǎn)海藻糖的底物，這樣不僅解決了液化液的去向問題，可以將液化液轉(zhuǎn)化成工業(yè)價值更高的海藻糖，同時原料碎米也可以得到更充分的利用，降低生產(chǎn)成本，這在工業(yè)上具有十分重要的意義。在大米蛋白粉制備中，為了減少板框過濾壓力，通常大米淀粉液化液DE值在16左右，造成組分含有較多的低分子量麥芽寡糖。但是，目前MTSase普遍對低分子量麥芽寡糖底物利用不足，導(dǎo)致以該底物制備海藻糖轉(zhuǎn)化率偏低。因而需要改造MTSase以提高海藻糖轉(zhuǎn)化率。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)當(dāng)中存在的以大米淀粉液化液為底物時，海藻糖的轉(zhuǎn)化率偏低，本發(fā)明利用基因工程和酶工程的手段，提高麥芽寡糖基海藻糖合成酶制備海藻糖時的海藻糖轉(zhuǎn)化率，為其工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造條件。

本發(fā)明提供了一種麥芽寡糖基海藻糖合成酶突變體，所述突變體是通過將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麥芽寡糖基海藻糖合成酶的第47氨基酸進(jìn)行突變得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，這些突變體與其親代的麥芽寡糖基海藻糖合成酶相比，海藻糖轉(zhuǎn)化率得到提高。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是通過將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麥芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楦彼岬玫降模麨镾47P。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是通過將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麥芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)楣劝滨０返玫降模麨镾47Q。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體是通過將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麥芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由絲氨酸突變?yōu)樘於彼岬玫降模麨镾47D。