[發明專利]一種茶葉黃嘌呤氧化酶拮抗劑高通量篩選方法

在審

• 申請號: 202110572934.2
• 申請日: 2021-05-25
• 公開（公告）號: CN113447579A
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 戴偉東;林智;彭佳堃;陳丹;郭麗;譚俊峰;高健健;施江
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院茶葉研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

本發明一種茶葉中黃嘌呤氧化酶拮抗劑的高通量篩選方法，屬于茶葉中活性成分篩選技術領域，具體包括以下幾個步驟：1）茶葉提取液的制備；2）茶葉提取液與黃嘌呤氧化酶進行共同孵育；3）超濾去除與黃嘌呤氧化酶未結合的化合物；4）解離獲取與黃嘌呤氧化酶結合的化合物；5）化合物結構鑒定；6）化合物抑制黃嘌呤氧化酶活性測定。該方法具有操作簡便、快速、成本低、篩選效率高等優點。

技術領域

本發明屬于茶葉中活性成分篩選技術領域，更具體地說，涉及一種茶葉中黃嘌呤氧化酶拮抗劑的高通量篩選新方法。

背景技術

高尿酸血癥是由嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄障礙所致的血尿酸增高，細胞外液尿酸呈超飽和的狀態。5％-12％高尿酸血癥患者會發展成為痛風，侵犯骨和關節，而且容易累積腎臟和心血管系統。高尿酸血癥和痛風已成為危害人類健康的一種嚴重的代謝性疾病。嘌呤代謝過程中關鍵酶的異常是尿酸生成增加的主要原因。黃嘌呤氧化酶是促進尿酸合成的一種關鍵酶，其拮抗劑可能具有降低人體尿酸的功效。因此從天然植物中篩選黃嘌呤氧化酶拮抗劑具有重要的意義。

茶是世界上最受歡迎的飲品之一，也是一種天然保健品。據統計，茶葉中含有450多種對人體有益的化合物成分。研究表明飲茶能夠明顯降低機體內尿酸水平，從而緩解痛風。然而由于茶葉是一個復雜的混合物，目前關于茶葉中具有降尿酸作用的化合物尚不明確，阻礙了茶葉來源的降尿酸保健品和降尿酸藥物的開發，因此急需開發能夠從茶葉復雜的混合物溶液中篩選具有降尿酸功效化合物的方法。

發明內容

針對現有技術中存在的問題，本發明設計的目的在于提供一種茶葉中黃嘌呤氧化酶拮抗劑的高通量篩選新方法。該方法將“黃嘌呤氧化酶-茶葉化合物”親和作用、超濾、基于液相色譜-質譜的代謝組學方法結合起來，用來高通量篩選茶葉中具有抑制黃嘌呤氧化酶活性的化合物。

本發明通過以下技術方案加以實現：

所述的一種茶葉中黃嘌呤氧化酶拮抗劑的高通量篩選方法，其特征在于包括以下步驟：

1)茶葉提取液的制備；

2)茶葉提取液與黃嘌呤氧化酶進行共同孵育；

3)超濾去除與黃嘌呤氧化酶未結合的化合物；

4)解離獲取與黃嘌呤氧化酶結合的化合物；

5)化合物篩選及結構鑒定；

6)化合物抑制黃嘌呤氧化酶活性測定。

進一步地，步驟1)中茶葉提取液的制備方法為：以濃度為0％-99％的甲醇水溶液或乙腈水溶液提取茶葉中的化合物，提取溫度為10-90℃，提取時間為2-120分鐘。

進一步地，步驟2)中茶葉提取液與黃嘌呤氧化酶共同孵育的步驟為：將茶葉提取液和黃嘌呤氧化酶溶液等體積進行混合，然后進行水浴孵育，孵育溫度為15-45℃，孵育時間為0.1-48小時，設為XOD組，同時設置對照組：將茶葉提取液和pH＝6.8的磷酸緩沖溶液等體積進行混合，然后進行水浴孵育，孵育溫度和孵育時間同XOD組。

進一步地，步驟3)中超濾去除與黃嘌呤氧化酶未結合的化合物的方法為：孵育結束后，將茶葉提取液和黃嘌呤氧化酶溶液的混合液進行離心超濾，超濾管規格為3KD至500KD，離心轉速為13000-15000g；并添加去離子水進一步清洗未與黃嘌呤氧化酶結合的化合物，清洗2-10次，棄去清洗溶液。

進一步地，步驟4)中解離獲取與黃嘌呤氧化酶結合的化合物的方法為：添加0.5-10mL甲醇水溶液于上述去離子水清洗后的超濾管中，使與黃嘌呤氧化酶相結合的化合物解離至甲醇水溶液中，進一步進行離心超濾，離心轉速為13000-15000g；收集甲醇水溶液。