[發明專利]一種L-蘇氨酸醛縮酶突變體及其應用

在審

• 申請號: 202110571939.3
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN113337494A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 吳堅平;鄭文隆;陳開通;徐剛;楊立榮
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 杭州知閑專利代理事務所(特殊普通合伙) 33315
• 代理人: 萬靜

本發明公開了一種L?蘇氨酸醛縮酶突變體及其應用。所述L?蘇氨酸醛縮酶突變體由野生型L?蘇氨酸醛縮酶突變所得，能夠以甘氨酸和對甲砜基苯甲醛為底物，以磷酸吡哆醛為輔酶，催化縮合反應生成L?syn?對甲砜基苯絲氨酸。使用本發明L?蘇氨酸醛縮酶突變體生產L?syn?對甲砜基苯絲氨酸具有以下優點：1、生產工藝簡單，反應條件溫和；2、L?蘇氨酸醛縮酶的選擇性高，產品光學純度高，無需拆分；3、原子利用率高，理論可達100％；4、生產過程環保，污染較小，符合綠色化學理念；5、產品分離純化簡單。

本申請是“一種L-蘇氨酸醛縮酶突變體、基因及制備L-syn-對甲砜基苯絲氨酸的方法”的分案申請，原申請的申請日為2020年1月17日，申請號為2020100508531。

技術領域

本發明涉及酶工程技術領域，特別是涉及一種L-蘇氨酸醛縮酶突變體、基因及制備L-syn-對甲砜基苯絲氨酸的方法。

背景技術

L-syn-對甲砜基苯絲氨酸是一種重要的醫藥中間體，應用于多種抗生素的合成。對甲砜基苯絲氨酸有兩個手性中心，具有四種異構體，分別是：L-syn-對甲砜基苯絲氨酸，L-anti-對甲砜基苯絲氨酸，D-syn-對甲砜基苯絲氨酸，D-anti-對甲砜基苯絲氨酸(圖1)。

目前，L-syn-對甲砜基苯絲氨酸主要有兩種生產方法。一種是化學法合成，使用硫酸銅為催化劑，利用金屬離子的絡合作用，對甲砜基苯甲醛和甘氨酸選擇性反應生成兩種順式的產物：L-syn-對甲砜基苯絲氨酸銅和D-syn-對甲砜基苯絲氨酸銅，酸不能直接進行拆分，只能繼續和乙醇進行酯化反應，生成外消旋的D,L-syn-對甲砜基苯絲氨酸乙酯，再進行手性拆分，實現D型和L型異構體的分離，從而制得光學純的L-syn-對甲砜基苯絲氨酸乙酯。此工藝主要存在以下缺點：理論收率只有50％、無效對映體難套用、工藝比較復雜。同時需要使用等摩爾量手性拆分試劑、單次拆分收率低、拆分試劑的回用和反應中的銅鹽會產生大量的廢水和廢鹽。另一種是將化學法和生物法結合，主要過程是先利用對甲砜基苯甲醛和甘氨酸在硫酸銅的催化作用下生成消旋的對甲砜基苯絲氨酸銅鹽，主要產物是L-syn-對甲砜基苯絲氨酸銅和D-syn-對甲砜基苯絲氨酸銅(圖2)。除去產品中的銅離子生成L-syn-對甲砜基苯絲氨酸和D-syn-對甲砜基苯絲氨酸混合物。再使用D-蘇氨酸醛縮酶分解D-syn-對甲砜基苯絲氨酸達到拆分的目的，得到光學純的L-syn-對甲砜基苯絲氨酸。此工藝存在以下缺點：生產工藝復雜，原子利用率不高，理論收率只能達到50％、同樣也會產生銅鹽環境污染問題。

相比之下，使用L-蘇氨酸醛縮酶突變體催化對甲砜基苯甲醛和甘氨酸直接生成L-syn-對甲砜基苯絲氨酸(圖3)，具有以下優點：

1、生產工藝簡單，反應條件溫和；

2、L-蘇氨酸醛縮酶的選擇性高，產品光學純度高；

3、無需拆分，原子利用率高，理論可達100％；

4、生產過程環保，污染較小，符合綠色化學理念；

5、下游分離純化工藝簡單。

利用L-蘇氨酸醛縮酶催化合成L-syn-對甲砜基苯絲氨酸的關鍵在于獲得能夠高選擇性合成L-syn-對甲砜基苯絲氨酸的酶。目前報道的L-蘇氨酸醛縮酶對α-碳具有較高的選擇性，ee(％)99％。而對β-碳的選擇性不高，de(％)在20-50％之間，產生L-syn-對甲砜基苯絲氨酸和L-anti-對甲砜基苯絲氨酸的混合物。因此目前沒有直接應用L-蘇氨酸醛縮酶合成高手性純度L-syn-對甲砜基苯絲氨酸的研究報道。

發明內容

本發明針對現有L-syn-對甲砜基苯絲氨酸合成工藝存在的缺陷，提供了一種利用L-蘇氨酸醛縮酶突變體制備L-syn-對甲砜基苯絲氨酸的方法，該方法原料利用率高，且可循環利用。產物易于分離提純且轉化率、收率及手性純度高；與化學催化工藝相比，工藝簡單，污染小。