[發(fā)明專利]一種新型氘代試劑的合成和應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2021-05-25
• 公開（公告）號(hào): CN113671060A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉永蓁;陳龍;朱海岸;徐小為
• 申請（專利權(quán)）人: 泰州葛林美克醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 南京禾易知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32320
• 代理人: 宋萍

本發(fā)明公開了一種之前已經(jīng)授權(quán)的氘代試劑在乳腺癌患者中甘油單酯的測定。該化合物與單甘油酯進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，可增加單甘油酯的質(zhì)譜響應(yīng)。通過與輕標(biāo)試劑聯(lián)合使用，可用于乳腺癌患者癌旁組織和癌組織中單甘油酯的檢測和相對定量分析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種已經(jīng)報(bào)道的氘代試劑在乳腺癌早期診斷中的應(yīng)用，屬于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

單甘油酯是一類參與體內(nèi)多種生理過程的活性物質(zhì)。研究表明，單甘油酯與多種疾病有密切的關(guān)系，例如糖尿病、肥胖癥、癌癥等。目前多采用間接檢測的方法對復(fù)雜樣品中單甘油酯混合物進(jìn)行鑒定，即將單甘油酯降解為甘油和對應(yīng)的游離脂肪酸，通過薄層色譜將游離脂肪酸分離后，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法對所得游離脂肪酸混合物進(jìn)行分離及鑒定。這種方法耗時(shí)且前處理過程復(fù)雜，易造成樣品損失。除此之外，對單甘油酯整體分子的質(zhì)譜檢測，受單甘油酯結(jié)構(gòu)中羥基基團(tuán)電離性質(zhì)的限制，僅能在負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測，降低了檢測的靈敏度，同時(shí)在二級(jí)質(zhì)譜中易丟失部分結(jié)構(gòu)信息，提高了檢測、鑒定及定量的難度。

因此，在本發(fā)明中，利用之前報(bào)道的氘代-3-硝基苯硼酸(d₄-NPB)，將輕標(biāo)及重標(biāo)衍生化試劑分別用于乳腺癌和癌旁組織中的單甘油酯衍生化，通過對輕/重標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)譜響應(yīng)比例的測定，可實(shí)現(xiàn)不同生理狀態(tài)下單甘油酯的相對定量分析。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為提供氘代-3-硝基苯硼酸的在乳腺癌早期診斷中的應(yīng)用。

衍生化反應(yīng)原理：

3-硝基苯硼酸在溶液中與氫氧根結(jié)合形成負(fù)離子形式后，與MAG中的二羥基基團(tuán)，脫去兩分子H₂O，形成一個(gè)穩(wěn)定的五元環(huán)，成功固定了單甘油酯分子的原有結(jié)構(gòu)，使其不易轉(zhuǎn)變?yōu)槠洚悩?gòu)體。衍生化產(chǎn)物以負(fù)離子的形式，且具有硼原子特有的同位素分布特征，更容易在負(fù)離子模式下被檢測，提高了質(zhì)譜的響應(yīng)。3-NPB溶解于乙腈：水＝1:1,10mM，加入氨水調(diào)節(jié)pH為9。衍生化時(shí)，100uLMAG標(biāo)準(zhǔn)溶液與10uL 10mM的3-NPB混合，37度，400rpm 反應(yīng)2小時(shí)。

主要以棕櫚酸單甘油酯(PG)、油酸單甘油酯(OG)、花生四烯酸單甘油酯(AG)、亞油酸單甘油酯(LG)、硬脂酸單甘油酯(SG)為例，首先由液相分離結(jié)果可以看出，單甘油酯經(jīng)過d₄-NPB衍生化后并不會(huì)影響其液相色譜行為，與d₀-NPB標(biāo)記的衍生化產(chǎn)物同時(shí)被洗脫。其次，從質(zhì)譜中檢測到每種單甘油酯都有質(zhì)量數(shù)差值為4Da的雙峰，同時(shí)具有B 元素的特異性同位素分布，這有利于快速鑒定復(fù)雜樣本中的單甘油酯。采用d₀/d₄-NPB 1:1 比例混合后衍生化，所得的產(chǎn)物質(zhì)譜信號(hào)波動(dòng)在10％以內(nèi)，證明所合成的氘代試劑效率與輕標(biāo)試劑效率無顯著差別。圖一A為3-NPB衍生化后經(jīng)色譜分離所得的MAG18:2的sn-2 異構(gòu)體，對應(yīng)4.39和4.58min；圖一B為sn-1異構(gòu)體，對應(yīng)洗脫時(shí)間為4.58min。對比可知 sn-2異構(gòu)體出峰時(shí)間為4.39min，表明3-NPB衍生化可用于捕獲相對不穩(wěn)定的異構(gòu)體。圖一 C和D為異構(gòu)體對應(yīng)質(zhì)譜圖，可檢測到與預(yù)期相同的m/z 502.299，并顯示硼的特征性同位素分布，可用于進(jìn)一步確證衍生化產(chǎn)物的出現(xiàn)?；?-NPB衍生化法對MAG的檢測，將其應(yīng)用于表征MAG作為潛在癌癥標(biāo)志物的檢測。

二、乳腺癌組織及癌旁組織衍生化后進(jìn)樣來驗(yàn)證氘代試劑的作用。

選擇38對乳腺癌組織和癌旁組織，采用3-NPB衍生化后經(jīng)色譜分離，進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測。通過建立標(biāo)曲對所檢測MAG進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn)圖二中所示5中MAG在癌組織和癌旁組織中分布有顯著性差異，可作為潛在生物標(biāo)志物。60mg組織加入4度預(yù)冷的甲醇研磨，隨后加入400uL在-80度預(yù)冷的甲醇沉淀蛋白。在-20度震蕩提取MAG，4度18000rpm離心 10min。上清轉(zhuǎn)移至新的EP管，氮吹后復(fù)溶于甲醇。加入3-NPB，37度，400rpm反應(yīng)2小時(shí)。

附圖說明