[發明專利]一種通過流式細胞儀同時檢測線粒體膜電位和質量的熒光探針及其合成方法

在審

• 申請號: 202110570964.X
• 申請日: 2021-05-25
• 公開（公告）號: CN113292474A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 李國平;黃興琳;樓忠澤;鄭莉美;聶雅潔
• 申請（專利權）人: 泛肽生物科技（浙江）有限公司
• 主分類號: C07D209/08
• 分類號: C07D209/08;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 浙江中桓凱通專利代理有限公司 33376
• 代理人: 李美寶

本發明涉及一種通過流式細胞儀同時檢測線粒體膜電位和質量的熒光探針及其合成方法。針對現有熒光探針檢測細胞內線粒體膜電位時需占用兩個熒光通道、易與線粒體隔離等情況，本發明的探針在流式細胞儀上使用檢測線粒體膜電位時，僅表現同一區段的激發波長范圍，在同一熒光通道中檢測，而且該探針在檢測線粒體膜電位的同時可以檢測線粒體的質量，達到聯合評估線粒體的效果。

技術領域

本發明涉及熒光探針檢測領域，具體涉及一種通過流式細胞儀同時檢測線粒體膜電位和質量的熒光探針及其合成方法。

背景技術

線粒體是在真核細胞中由雙層高度特化的單位膜圍成的半自主性細胞器，能產生能量以維持細胞正常的生理活動，有大量研究顯示，線粒體參與生物的生長、發育、代謝、衰老、疾病、死亡以及生物進化等方面的活動。線粒體在不同的致病刺激因素下，非常容易發生結構和功能的損傷，從而直接影響機體其他細胞組織的正常功能，當線粒體受損時，線粒體的膜電位下降，形態功能發生變化。為應對這種損傷，細胞通過線粒體質量調控進行選擇性的清除受損線粒體。

目前市場上針對線粒體檢測大多依賴于線粒體膜電位來進行檢測，典型的探針如JC-1，通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。但該探針在流式細胞儀上使用時需要占用兩個熒光通道，不利于多種指標同時測量，同時該熒光探針很容易與線粒體隔離，當細胞的線粒體的膜電位消失，它們就極易被洗掉。這種特性限制了它們應用在一些實驗中，例如一些細胞需要被醛類物質固定或者其他試劑會影響線粒體的能量狀態，傳統的線粒體染料就無法使用。市場上也存在非線粒體膜電位依賴的探針，能夠染色活細胞中的線粒體，同時也能被保留在細胞經歷過固定的過程，典型的探針如Mito Tracker Green，它可用于檢測線粒體質量，該指標能體現線粒體形態完整性，但該探針無法體現線粒體膜電位去極化的變化，同時在流式細胞儀上進行檢測時，該探針檢測的熒光值與線粒體質量關系不明確，例如不同的探針濃度，不同的儀器狀態等都會影響探針在儀器上的熒光值。因此，開發一種能同時檢測線粒體膜電位和質量的探針，聯合評估線粒體的功能，更能體現細胞真實的狀態，對于線粒體的檢測具有重要的意義。

發明內容

因此，本發明提供一種同時檢測細胞內線粒體膜電位和質量的探針，其結構式為：

。

本發明提供一種同時檢測細胞內線粒體膜電位和質量的探針的合成方法，具體包括以下步驟：

S10：將化合物A、4-氯甲基苯甲酸甲酯和氫氧化鈉溶于N,N-二甲基甲酰胺中，反應得到A1；

S20：將化合物M1溶于氯甲烷中，悶罐反應，得到M2；

S30：將3-二甲氨基丙烯醛溶于乙腈中，冰浴下，滴加三氯氧磷，攪拌，混合液冰浴下滴加至M2的乙腈溶液中，反應得到M3；

S40：將M3、A1溶于甲苯、 N-甲基吡咯烷酮溶液中，反應得到M4；

S50：將M4溶于甲醇中，分批加入NaBH₄，淬滅，過濾，析出固體，過濾，烘干濾餅，得到M5；

S60：將M5、三苯基膦、四氯化碳溶于N,N-二甲基甲酰胺，攪拌，粗品經C18液相純化得到目標產品TM；

其中A、A1、M1、M2、M3、M4、M5、TM的結構式分別為：

、、、 、、、、 。

進一步地，步驟S10的反應條件為在80°C下反應6小時，過濾，萃取，用無水硫酸鈉干燥有機相，濃縮，粗品經過柱層析得到A1。

進一步地，步驟S30的反應條件為升至室溫反應4小時，加水淬滅反應，加入氫氧化鈉水溶液，析出固體，過濾。

進一步地，步驟S10中化合物A、4-氯甲基苯甲酸甲酯和氫氧化鈉的質量比為1：（1~2）：（0.5~1）。

進一步地，步驟S30中3-二甲氨基丙烯醛和三氯氧磷的質量比為1：（1~2）。