[發(fā)明專利]一種果膠裂解酶突變體ΔPelG403及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110563930.8
• 申請(qǐng)日: 2021-05-24
• 公開（公告）號(hào): CN113549608B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 成莉鳳;彭源德;段盛文;馮湘沅;楊琦;鄭科;彭正紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所
• 主分類號(hào): C12N9/88
• 分類號(hào): C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 長(zhǎng)沙智路知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43244
• 代理人: 張毅

本發(fā)明公開了一種果膠裂解酶突變體ΔPelG403及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用，該果膠裂解酶突變體ΔPelG403為將野生型果膠裂解酶PelG403柔性區(qū)第129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突變?yōu)榇蠓肿恿坷i氨酸；其氨基酸序列和核苷酸序列分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本發(fā)明提供的突變體酶在堿性條件下，酶活力和耐熱性能有明顯的提高，解決了野生型果膠裂解酶在堿性條件下催化活性低和熱穩(wěn)定性不足的問題，為利用該酶在棉麻加工、制漿造紙、工業(yè)廢水處理等行業(yè)中的應(yīng)用創(chuàng)造了良好條件。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種果膠裂解酶突變體ΔPelG403及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

果膠裂解酶(Pectate lyase，簡(jiǎn)稱Pel，EC 4.2.2.2)通過反式消去作用以隨機(jī)方式切割果膠酸或果膠的α-1，4-糖苷鍵，生成C₄-C₅不飽和寡聚半乳糖醛酸；其最適pH一般在堿性范圍，催化作用依賴于Ca²⁺。Starr和Moran于1962年在Erwinia carotovora和Bacilluspolymyxa的培養(yǎng)物中首次發(fā)現(xiàn)果膠裂解酶；隨后，在Penicillium sp.、Paenibacillus sp.和Psedomonas sp.等微生物資源中均發(fā)現(xiàn)了果膠裂解酶。

果膠裂解酶被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，如造紙、咖啡和茶發(fā)酵、紡織和植物纖維加工、采油和處理工業(yè)廢水等。

作為一種重要的清潔生產(chǎn)用酶，果膠裂解酶?jìng)涫荜P(guān)注，其主要應(yīng)用于紙漿漂白和紡織品的生物精煉等行業(yè)。酶解精煉方法能從根本上解決傳統(tǒng)工藝存在的環(huán)境和能源等問題，在質(zhì)量與環(huán)保方面具有傳統(tǒng)工藝無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。果膠裂解酶的工業(yè)化應(yīng)用主要取決于其酶活力的最適溫度、最適pH、穩(wěn)定溫度和穩(wěn)定pH等酶學(xué)性質(zhì)。因此，從微生物菌種資源中發(fā)掘優(yōu)良的果膠裂解酶，選擇適合工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的果膠裂解酶是關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

果膠裂解酶在工業(yè)化應(yīng)用過程中常會(huì)遇到高溫環(huán)境，溫度過高會(huì)破壞果膠酶蛋白中的鹽橋、氫鍵、范德華力和疏水相互作用等非共價(jià)鍵，從而破壞果膠酶的空間結(jié)構(gòu)，使其從折疊狀態(tài)變?yōu)橄鄬?duì)展開狀態(tài)，果膠酶活力降低，甚至酶失活。據(jù)報(bào)道，目前大多數(shù)果膠裂解酶都來源于常溫微生物，其在50℃下保溫1h，基本全部失活。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)現(xiàn)有果膠裂解酶進(jìn)行分子改造，是獲得高酶活力和耐高溫優(yōu)良酶種的有效手段之一。定點(diǎn)突變是基于果膠裂解酶已知或預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)信息及催化機(jī)理，對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系進(jìn)行分析，推測(cè)出影響酶穩(wěn)定性、催化活性等的主要位點(diǎn)，再對(duì)其關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行修飾或替換；其具有突變率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于酶性能的改良。

截至目前，尚未見到點(diǎn)突變改造果膠裂解酶的有關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種果膠裂解酶突變體ΔPelG403及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種果膠裂解酶突變體ΔPelG403，其將柔性區(qū)第 129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突變?yōu)榇蠓肿恿坷i氨酸。

具體地，在上述技術(shù)方案中，通過將位于第128-137位的柔性區(qū)(無(wú)規(guī)卷曲和轉(zhuǎn)角區(qū))中的第129位的氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變，具體為在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的pelG403基因序列(GenBank登錄號(hào)： JX964998)的基礎(chǔ)上，對(duì)其編碼的氨基酸進(jìn)行取代，所述氨基酸取代點(diǎn)為第129位丙氨酸，增加柔性區(qū)域的分子間作用力(范德華力等)，從而提高酶的耐熱性。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述果膠裂解酶突變體ΔPelG403 的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了編碼所述果膠裂解酶突變體的基因ΔpelG403。