[發明專利]一種篩選與目的化合物合成相關的基因的方法與應用

在審

• 申請號: 202110563411.1
• 申請日: 2021-05-24
• 公開（公告）號: CN113337589A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 蘇健裕;郭思源;傅明輝
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

1.一種篩選與目的化合物合成相關的基因的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)選擇目的化合物表達量有差異的不同樣本，提取得到不同樣本的總RNA；

(2)對步驟(1)得到的不同樣本的總RNA分別進行三代全長轉錄組測序；

(3)對步驟(2)測序得到的原始數據進行分析，去冗余聚類，并用非全長序列對其進行校正，得到全長轉錄本；

(4)對步驟(1)得到的不同樣本的總RNA分別進行二代測序，對下機數據進行數據質控；

(5)將步驟(3)得到的三代轉錄組的測序數據和步驟(4)得到的二代轉錄組的測序數據進行比對，以三代測序為參考，將二代的測序結果比對到三代，在二代數據中得到全長序列，降低二代測序中的拼接錯誤以及降低嵌合體的數量；同時根據二代的結果對三代測序中可能存在的堿基錯誤進行糾正，得到更為準確地測序結果；將三代測序得到的轉錄本作為參考，在不同的蛋白數據庫進行比對，得到跟給定轉錄本具有最高序列相似性的蛋白，對步驟(3)得到的全長轉錄本進行基因功能注釋和基因結構分析，得到目的化合物合成過程中的相關基因；

(6)用RSEM進行序列比對定量，統計每個樣本中基因檢測的情況；表達量以原始數據量和RPKM展示，對二代測序深度進行校正，再對基因或轉錄本的長度進行校正，獲得基因的RPKM值后，再進行后續差異表達分析；

(7)利用軟件DESeq2對基因表達水平分析中得到的數據量數據進一步分析，篩選FDR0.05且|log2FC|1的基因為顯著差異基因，得到在合成目的化合物的過程中相對比較重要的基因。

2.根據權利要求1所述的篩選目的化合物合成相關的基因的方法，其特征在于還包括如下步驟：

(8)選擇若干個差異表達基因進行熒光定量分析，證明步驟(7)分析得到的結果的可信度。

3.根據權利要求1或2所述的篩選目的化合物合成相關的基因的方法，其特征在于：步驟(1)和步驟(5)中所述的目的化合物為樟科陰香中萜類物化合物。

4.根據權利要求1或2所述的篩選目的化合物合成相關的基因的方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的樣本通過如下方法確定：通過索氏提取的方法，在無水乙醇中提取不同陰香樣本中的有機化合物，并通過氣相質譜聯用檢測成分和含量，確定樟科陰香中萜類物化合物表達量有差異的不同樣本；

步驟(1)中所述的總RNA是OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8～2.0、OD₂₆₀/OD₂₃₀＝1.8～2.0的RNA。

5.根據權利要求1或2所述的篩選目的化合物合成相關的基因的方法，其特征在于：

步驟(2)中所述的三代全長轉錄組測序的測序平臺為Pacbio Sequel；

步驟(4)中所述的二代測序的平臺為Illumina平臺。

6.根據權利要求5所述的篩選目的化合物合成相關的基因的方法，其特征在于：

所述的三代全長轉錄組測序的步驟如下：

1)對總RNA進行逆轉錄，得到第一鏈cDNA；

2)對第一鏈cDNA進行PCR，擴增得到含雙鏈cDNA的PCR產物；

3)對步驟2)得到的PCR產物進行純化；

4)SMRTbell文庫構建：包括DNA損傷修復、末端修復、連接適配體、文庫質量評估；

5)將SMRTbell文庫退火結合引物和聚合酶，采用MagBead Loading上機測序；

步驟(4)中所述的二代測序包括如下步驟：

A、從總RNA中分離得到具有polyA尾巴的真核mRNA；接著將真核mRNA片段化，以片段化的mRNA為模板，逆轉錄得到cDNA第一條鏈；隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymeraseI體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈，接著純化，得到純化后的雙鏈cDNA；

B、將步驟A最終得到的雙鏈cDNA經過末端修復、加A尾并連接測序接頭，篩選150-250bp的cDNA，進行PCR擴增，將得到的PCR產物純化，獲得文庫；

C、將步驟B得到的文庫進行二代測序。