[發(fā)明專利]間歇性饑餓促進心肌細胞成熟的方法

有效

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• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113061573B
• 公開（公告）日: 2023-03-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡士軍;雷偉;楊靜思;于淼
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明公開了一種間歇性饑餓促進心肌細胞成熟的方法。本發(fā)明用平衡鹽溶液間歇性饑餓處理1?5小時/天并持續(xù)5?15天，處理結(jié)束后換成心肌細胞培養(yǎng)基，檢測相關(guān)成熟指標提高。發(fā)現(xiàn)平衡鹽溶液間歇性饑餓處理心肌細胞，可誘導了心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，代謝和電生理上的成熟，操作簡單，成本低。因此，這是一種創(chuàng)新性的誘導心肌成熟的方式，有助于解決心肌細胞成熟度低的問題，同時也可推動多能干細胞在心血管病中的臨床應用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種間歇性饑餓促進心肌細胞成熟的方法。

背景技術(shù)

心血管疾病已成為人類健康的頭號殺手，最常見的疾病類型是心肌梗死，其主要特征是由冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。由于成年心肌細胞的再生能力有限，原代人心肌細胞在體外難以獲得和維持，心臟疾病研究和治療面臨瓶頸。人多能干細胞(PSC)主要包括胚胎干細胞(ESC)和誘導多能干細胞(iPSC)，其可在體外高效誘導分化為心肌細胞，且操作簡單。在心臟病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和細胞治療等方面顯示出巨大潛力。但由于體外培養(yǎng)環(huán)境的不同和培養(yǎng)技術(shù)上的局限，PSC來源心肌細胞(PSC-CM)的生理狀態(tài)無法像成體心肌細胞那樣成熟，而更接近于胎兒心肌細胞狀態(tài)。PSC-CM的不成熟特征阻礙了心血管疾病的研究進程和治療效果。所以，提高PSC-CM的成熟度是亟待解決的問題。

心肌細胞成熟的主要特征包括成熟性肥大、有組織性規(guī)律性肌原纖維排列、線粒體DNA拷貝數(shù)增加、氧化磷酸化能力增加、以及電生理和鈣生理能力增強等。目前，用于提高PSC-CM成熟的方法包括長期培養(yǎng)法、組織工程、藥物刺激和生物電刺激等。

(1)長期培養(yǎng)心肌細胞。將PSC-CM連續(xù)體外培養(yǎng)了60天到1年，可使心肌細胞呈現(xiàn)出成熟心肌狀態(tài)，如：心肌細胞伸長，細胞大小增加，肌節(jié)排列整齊等。但是長期培養(yǎng)很費時，成熟程度依然較低，穩(wěn)定性差。

(2)組織工程培養(yǎng)。隨著組織工程在PSC-CM培養(yǎng)方案的改進，以基質(zhì)膠或水凝膠等新型材料為介質(zhì)，形成多種類型的心肌/心臟組織工程，如：心臟補片，3D心臟類器官等，可明顯促進心肌細胞結(jié)構(gòu)的成熟。但是，其特殊材料難以獲得，操作技術(shù)難度大，對細胞生理狀態(tài)影響較大。

(3)電刺激來促進心肌細胞的成熟。最常用的就是通過電場刺激增強細胞排列和肌節(jié)結(jié)構(gòu)。比如，在接近生理頻率的電刺激PSC-CM，從1赫茲到6赫茲逐步增加刺激強度，使用一段時間后發(fā)現(xiàn)可改進心肌細胞成熟的多個方面，包括心肌細胞排列，肌節(jié)結(jié)構(gòu)，鈣處理能力和動作電位能力的增強。其局限性是對設(shè)備要求高，不適合大規(guī)模培養(yǎng)處理，需要花相當長的時間刺激和數(shù)據(jù)分析，并且下游分析難度高。

可見這些方法對時間，成本和技術(shù)都有著較高的要求，難以推廣。因此，迫切需要更有效的方法在可承受的時間和成本的前提下，推動PSC-CM的成熟。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明模擬生理狀態(tài)下心肌成熟的過程，建立利用平衡鹽溶液溶液間歇性饑餓提高PSC-CM成熟度的方法。其操作簡單，成本低，成熟周期較短，且能夠較全面的促進心肌成熟。

本發(fā)明的第一個目的是提供了一種間歇性饑餓促進心肌細胞成熟的方法，包括如下步驟：

S1、獲得純化的心肌細胞，清洗去除表面培養(yǎng)液；

S2、加入平衡鹽溶液進行饑餓處理1～5小時，換回心肌細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)19～23小時；

S3、按照S1～S2步驟處理方法，連續(xù)處理5～15天進行間歇性饑餓；

S4、間歇性饑餓后繼續(xù)培養(yǎng)，獲得成熟心肌細胞。

進一步地，所述的心肌細胞為多能干細胞分化的心肌細胞或分離的原代心肌細胞或商業(yè)化的心肌細胞系。

進一步地，商業(yè)化的心肌細胞系包括HL-1心肌細胞系或H9C2心肌細胞系。

進一步地，在S1步驟中，清洗采用緩沖液進行清洗。