[發明專利]一種高效分離玉米內生固氮菌的方法

有效

• 申請號: 202110558228.2
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113174346B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 艾超;張儷予;徐新朋;何萍;周衛
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12R1/065
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 賈耀淇

本發明公開了一種高效分離玉米內生固氮菌的方法，屬于微生物領域。本發明利用氮供應不充足條件下玉米對固氮菌的選擇性富集效應，在無需外部動力條件下，利用玉米根壓作用快速獲得包含豐富固氮菌資源的玉米輸導組織汁液，并通過對輸導組織汁液的兩次分離培養，最大限度保持了樣本中微生物的種類和活性。本發明借助植物自身的選擇富集機制，能夠快速篩選到與宿主作物互利共生的高效內生固氮菌株，有效提高了固氮菌的篩選效率，操作簡單，時效性好，是一種輕簡、快捷、高效的固氮菌分離培養技術。

技術領域

本發明涉及微生物領域，特別是涉及一種高效分離玉米內生固氮菌的方法。

背景技術

固氮微生物是指通過生命活動，將空氣中游離態的氮素直接轉變為含氮化合物的微生物。其中根瘤菌-豆科植物的固氮作用已廣為人知，但這一過程僅限于豆科植物。如何從復雜的土壤微生物資源庫中分離出可與非豆科作物共生的高效固氮菌株，補充作物生長發育所需的氮素，減少農業化肥施用，維持作物健康生長和產量提升，已成為新一輪農業綠色革命的重要方向。

限制非豆科作物高效生物固氮的瓶頸是功能菌株的宿主適應性問題。由于植物自身免疫系統的保護，并不是所有從土壤中分離獲得的固氮菌均可以與宿主植物形成互利共生關系。通過長期的生物進化，植物已形成完善的多步篩選機制來控制微生物在植物根表、根內和地上部的定植，允許特定有益微生物在植物體內富集，使得作物具有更強的環境適應性和抗脅迫能力。

目前，內生固氮菌的分離培養方法主要包括兩類：1)從土壤等環境樣品中直接分離篩選，該類方法由于篩選過程不涉及植物活體，沒有考慮固氮菌宿主適應性問題，導致大部分獲得的菌株在實際應用過程中不能與宿主作物形成良好的互利共生關系，應用效果不佳；2)從植物某一器官或組織中收集篩選，該類方法篩選的材料盡管是植物體，但屬于靜態地從單一部位取樣，沒有考慮植物自身對有益微生物的富集效應，同時需要對固體植物樣本進行研磨提取等繁瑣操作，無法第一時間完成分離培養，導致時效性差、篩選效率低。

目前，尚缺少一種高效分離玉米內生固氮菌的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效分離玉米內生固氮菌的方法，以解決上述現有技術存在的問題。該方法借助植物自身的選擇富集機制，能夠快速篩選到與宿主作物互利共生的高效內生固氮菌株，有效提高了固氮菌的篩選效率。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

技術方案之一，提供了一種分離玉米內生固氮菌的方法，具體步驟包括：

采集低肥力土壤生長的玉米植株的輸導組織汁液，分離篩選得到玉米內生固氮菌；所述低肥力土壤總有機碳含量不超過7.5g/kg，土壤全氮含量不超過1.6g/kg，土壤硝態氮含量不超過6mg/kg。

低肥力土壤由于無機氮素供應不充足，玉米將充分利用內生菌的固氮作用，從土壤中選擇性地富集固氮菌等有益微生物。其輸導組織汁液包含豐富固氮菌資源，對其進行分離篩選，即可快速高效得到玉米內生固氮菌。

優選的，所述低肥力土壤當季未施加氮肥。

優選的，所述低肥力土壤質量含水量大于10％，不超過20％。

土壤質量含水量可以通過自然降雨和人工澆水來控制，但降雨或澆水48小時后方可取樣。土壤含水量過高使得輸導組織汁液過多，存在稀釋效應，降低篩選效率，同時土壤含水量過高使得田間操作難度增加，增加污染風險；土壤含水量過低則無法獲得充足的輸導組織汁液，影響下一步的固氮菌篩選。

優選的，所述玉米植株為生育期處于大喇叭口期至開花期的玉米植株。

優選的，所述輸導組織汁液的采集方法為：截斷玉米第三節莖，將收集裝置連接在截斷處進行采集。