[發(fā)明專利]一種快速篩選基因編輯豬陽性細(xì)胞系的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110557343.8
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113249456B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏紅江;趙紅業(yè);趙恒;角德靈;范檸粼
• 申請（專利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/06
• 代理公司: 北京隆達(dá)恒晟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11899
• 代理人: 李中強(qiáng)

本發(fā)明涉及一種快速篩選基因編輯豬陽性細(xì)胞系的方法，屬動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明針對已知的不同基因編輯類型的豬陽性成纖維細(xì)胞系，進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定，基于細(xì)胞PCR條帶灰度值，篩選獲得細(xì)胞基因型鑒定所需的最低細(xì)胞量；將目的基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至豬成纖維細(xì)胞并進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)篩選，當(dāng)單克隆細(xì)胞系形成時(shí)，摳取后于培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)并按上述最低細(xì)胞量計(jì)數(shù)進(jìn)行基因型鑒定，經(jīng)鑒定后立即進(jìn)行體細(xì)胞核移植，取出胎兒分離培養(yǎng)及鑒定后獲得大量轉(zhuǎn)基因豬陽性成纖維細(xì)胞系。本發(fā)明克服了基因編輯豬陽性細(xì)胞系篩選周期長、效率低、成功率低的問題，對促進(jìn)轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)具有重要的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種快速篩選基因編輯豬陽性細(xì)胞系的方法。

背景技術(shù)

體細(xì)胞核移植技術(shù)從誕生至今已超過二十年的歷史，是目前研究中唯一能通過豬體細(xì)胞獲得具有發(fā)育全能性豬胚胎的技術(shù)，加之動物基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)，體細(xì)胞核移植技術(shù)也是生產(chǎn)不同基因編輯豬個(gè)體的主要方法，在動物基因遺傳生物學(xué)、人類疾病模型以及異種器官移植的研究中得到了廣泛的應(yīng)用，因此，豬體細(xì)胞核移植技術(shù)移植是生命科學(xué)界研究的熱點(diǎn)和關(guān)注的焦點(diǎn)，大量基因編輯豬陽性細(xì)胞的篩選是各種基因編輯豬克隆生產(chǎn)的前提和基礎(chǔ)。

目前，豬體細(xì)胞核移植多選用胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞，這種方法打破了豬等大動物因缺乏胚胎干細(xì)胞而無法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬的限制。然而，體外培養(yǎng)的豬成纖維細(xì)胞的壽命較短，易老化，不易進(jìn)行長期的傳代培養(yǎng)，不能經(jīng)受一些復(fù)雜的基因修飾和長期的篩選鑒定，而且實(shí)現(xiàn)基因編輯的效率也非常低、所需細(xì)胞篩選周期長、篩選過程復(fù)雜，現(xiàn)階段，選擇豬胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植的供體細(xì)胞成功獲得克隆豬已有大量報(bào)道。

為了獲得目的基因修飾的克隆豬個(gè)體，還需在體外對豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行基因修飾并在發(fā)生大量隨機(jī)基因修飾的細(xì)胞群體中把目的基因已穩(wěn)定修飾的細(xì)胞篩選出來，并作為體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞，其方法是將大量發(fā)生目的基因隨機(jī)修飾的細(xì)胞群體進(jìn)行極度稀釋后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，獲得數(shù)個(gè)基因型各異的單克隆細(xì)胞系，再對不同克隆細(xì)胞系進(jìn)行基因型鑒定，篩選出目的基因穩(wěn)定修飾的單克隆細(xì)胞系用作核移植的供體細(xì)胞，傳統(tǒng)的鑒定方法需要提供大量的細(xì)胞系提取DNA做基因型鑒定，這時(shí)，會致使剩余單克隆細(xì)胞系的數(shù)量減少、細(xì)胞活力降低、細(xì)胞出現(xiàn)老化、細(xì)胞間的信號傳遞減弱而使細(xì)胞增殖減慢，甚至經(jīng)過再次傳代后而導(dǎo)致長期篩選的單克隆細(xì)胞系死亡，使細(xì)胞篩選的成功率大大降低，嚴(yán)重制約了轉(zhuǎn)基因克隆豬的生產(chǎn)效率。

發(fā)明內(nèi)容

針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種快速篩選基因編輯陽性細(xì)胞系的方法，本方法在已有的不同基因編輯類型豬陽性細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，利用顯微操作系統(tǒng)對已知的不同基因編輯類型的豬陽性成纖維細(xì)胞系分別按不同的細(xì)胞量要求準(zhǔn)確計(jì)數(shù)后進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定，基于細(xì)胞PCR條帶灰度值，篩選獲得細(xì)胞基因型鑒定所需的最低細(xì)胞量。為驗(yàn)證利用所需的最低細(xì)胞量鑒定克隆點(diǎn)細(xì)胞系結(jié)果的可行性，將目的基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至豬成纖維細(xì)胞并進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)篩選，當(dāng)單克隆細(xì)胞系形成時(shí)，摳取后于96孔板培養(yǎng)并按上述最低細(xì)胞量計(jì)數(shù)進(jìn)行基因型鑒定，經(jīng)鑒定后立即進(jìn)行體細(xì)胞核移植，取出胎兒分離培養(yǎng)及鑒定后獲得大量轉(zhuǎn)基因豬陽性成纖維細(xì)胞系。本發(fā)明克服了基因編輯豬陽性細(xì)胞系篩選效率低、成功率低的問題，能夠在最短的時(shí)間內(nèi)高效地篩選獲得大量的基因編輯豬成纖維細(xì)胞系，對促進(jìn)轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)和批量克隆具有重要的意義。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

所述的快速篩選基因編輯豬陽性細(xì)胞系的方法，具體步驟為：

1）確定豬成纖維細(xì)胞基因型鑒定所需的最低細(xì)胞量

針對已知的不同基因編輯類型的豬陽性成纖維細(xì)胞系，進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定，基于細(xì)胞PCR條帶灰度值、酶切結(jié)果和測序結(jié)果，篩選獲得細(xì)胞基因型鑒定所需的最低細(xì)胞量；

2）轉(zhuǎn)基因陽性豬成纖維細(xì)胞系的篩選