[發(fā)明專利]表征宿主細(xì)胞蛋白中酯酶對聚山梨酯降解活性的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110556872.6
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113155823A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王偉文;袁梵雨;陳全民;郭哲明
• 申請（專利權(quán)）人: 上海藥明生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 余穎

在此公開了一種表征宿主細(xì)胞蛋白中酯酶對聚山梨酯降解活性的方法，所述方法包括：a)將包含宿主細(xì)胞蛋白的樣品與乙酸萘酯反應(yīng)；b)樣品與乙酸萘酯的反應(yīng)產(chǎn)物與固藍(lán)B鹽進(jìn)行顯色反應(yīng)；和c)檢測顯色反應(yīng)產(chǎn)物在550nm至600nm處的吸光度；樣品與乙酸萘酯反應(yīng)引起吸光度增加表明樣品中存在宿主細(xì)胞蛋白中酯酶對聚山梨酯的降解活性。本申請為表征宿主細(xì)胞蛋白中酯酶對聚山梨酯降解活性提供了一種方便快捷，成本低，靈敏度高的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表征宿主細(xì)胞蛋白中酯酶對聚山梨酯降解活性的可定量的方法。

背景技術(shù)

生物醫(yī)藥技術(shù)是當(dāng)今醫(yī)藥工藝發(fā)展的核心力量。以單克隆抗體類藥物為典型代表的生物制品是治療惡性腫瘤、自身免疫病以及阿爾茲海默等疾病的重要藥物種類。

聚山梨酯例如聚山梨酯20和80是生物制藥中最常用的表面活性劑，它們可以改善蛋白質(zhì)制劑藥品的穩(wěn)定性并在蛋白質(zhì)制劑藥品的長期儲存和運輸過程中防止蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集和變性，從而阻止蛋白質(zhì)制劑藥品質(zhì)量的下降。然而聚山梨酯在一定條件下容易發(fā)生水解，則會造成蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，引起藥品質(zhì)量的下降。聚山梨酯的水解機理已經(jīng)被行業(yè)廣泛的研究，除了酸和堿的誘導(dǎo)水解外，宿主細(xì)胞蛋白(HCP)與目標(biāo)蛋白質(zhì)共同純化，并最終殘留在蛋白質(zhì)制劑藥品中，是最主要的造成聚山梨酯水解的原因。由于在蛋白質(zhì)制劑藥品的早期開發(fā)過程中，用于檢測HCP的手段匱乏，造成在蛋白質(zhì)制劑開發(fā)過程中不得不忽略掉HCP對聚山梨酯降解情況影響的研究，結(jié)果在蛋白質(zhì)制劑藥品的長期儲存和運輸過程中，容易引起蛋白質(zhì)的聚集和變性，在后期的調(diào)查和研究中耗費更多的資源用于解決藥品質(zhì)量下降的問題。基于上述的原因，亟需一種能夠在蛋白質(zhì)制劑藥品開發(fā)的早期方便、快捷、高靈敏度檢測HCP中酯酶對聚山梨酯降解活性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題滿足現(xiàn)有技術(shù)中的需求，本發(fā)明提供了一種表征宿主細(xì)胞蛋白中酯酶對聚山梨酯降解活性的方法，所述方法可定量。具體地說，本發(fā)明提供了一種表征宿主細(xì)胞蛋白中酯酶對聚山梨酯降解活性的方法，其特征在于，所述方法包括：

a)將包含宿主細(xì)胞蛋白的樣品與乙酸萘酯反應(yīng)；

b)樣品與乙酸萘酯的反應(yīng)產(chǎn)物與固藍(lán)B鹽進(jìn)行顯色反應(yīng)；和

c)在550nm至600nm的波長處檢測顯色反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度；

樣品與乙酸萘酯反應(yīng)引起所述吸光度增加表明樣品中存在宿主細(xì)胞蛋白中酯酶對聚山梨酯的降解活性。

其中，所述樣品可以是宿主細(xì)胞培養(yǎng)和收獲后各工段、各節(jié)點采集的中間產(chǎn)物，也可以是最終純化后的終產(chǎn)品。本發(fā)明方法還能夠確定樣品中酯酶的酶活力，比活力和/或單位體積活力從而定量表征宿主細(xì)胞蛋白中酯酶對聚山梨酯的降解活性。

本發(fā)明的方法能夠定量分析中間產(chǎn)物是否存在會降解聚山梨酯的酯酶活性。本發(fā)明的方法能夠用于下游純化工藝開發(fā)中，通過定量酯酶活性隨著下游工藝的優(yōu)化而發(fā)生的下降，指導(dǎo)純化工藝尤其是去除宿主細(xì)胞蛋白中酯酶的工藝開發(fā)。本發(fā)明的方法能夠用于對終產(chǎn)品例如原液或成品中殘留酯酶的活性進(jìn)行定量，指導(dǎo)評估聚山梨酯因HCP降解的風(fēng)險。

附圖說明

圖1：實施例之一中，萘酚含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，橫坐標(biāo)是測得的吸光度，縱坐標(biāo)是萘酚含量。

圖2：實施例之一中，聚山梨酯80競爭性抑制酯酶對乙酸萘酯降解活性的米氏方程雙倒數(shù)圖。其中，橫坐標(biāo)為1/[S]，縱坐標(biāo)是1/v。

具體實施方式

本文中，除非特別指定，名稱、量詞或單位前的“一”或“1”表示存在即數(shù)量上至少為一，因此涵蓋復(fù)數(shù)含義。

本文中，除非特別指定，本文述及的各項技術(shù)特征，例如組分、含量、步驟、條件參數(shù)、參數(shù)值、組件、連接關(guān)系、工作關(guān)系等等，它們的組合方式不限于本文具體描述的各個實施方式和實施例，其他任意組合方式同樣屬于本發(fā)明的范疇。