[發(fā)明專利]一種制備斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白的基因工程菌及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110555793.3
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113373169A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣瑤;李舒盈;桂文君
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/53;C12N9/12;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 金杭

本發(fā)明公開了基因工程領(lǐng)域的一種制備斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白的基因工程菌及方法，包括所述蛋白基因prkacaa的克隆、重組表達載體pET?28a?prkacaa和基因工程菌的構(gòu)建，基因工程菌誘導(dǎo)表達及目標蛋白表達形式分析，再通過鎳離子親和層析柱純化獲得目標蛋白。本發(fā)明提供的操作方法簡便，成本低，重復(fù)性好，制備的目標蛋白可溶，純度高，可應(yīng)用于斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白的功能研究，也為制備該蛋白的多克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種制備斑馬魚蛋白激酶A α催化亞基蛋白的基因工程菌以及制備斑馬魚蛋白激酶A α催化亞基蛋白的方法。

背景技術(shù)

蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，又稱cAMP依賴的蛋白激酶A(cyclic-AMPdependent protein kinase A)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調(diào)控眾多關(guān)鍵細胞活動，包括細胞代謝、基因表達和細胞增殖等。

不同生物中蛋白激酶A的催化亞基(catalytic subunit，PKAc)和調(diào)節(jié)亞基(regulatory subunit，PKAr)存在不同的亞型，人(Homo sapiens)的未活化的PKA是一種異四聚體全酶，由一個調(diào)節(jié)亞基二聚體與兩個失活狀態(tài)的催化亞基結(jié)合而成，催化亞基具有α，β，γ三種亞型，調(diào)節(jié)亞基具有Iα，Iβ，IIα，IIβ四種亞型，其中PKAα催化亞基在體內(nèi)普遍存在，是最常見的一種催化亞基。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的通過對斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白基因的克隆、表達載體的構(gòu)建、基因工程菌誘導(dǎo)表達目標蛋白以及目標蛋白的純化，從而獲得斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白。

一種含有斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白全長編碼基因prkacaa的重組表達載體pET-28a-prkacaa，所述prkacaa序列為SEQ ID N0.1。

一種包含重組表達載體pET-28a-prkacaa的基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa。

一種由基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa誘導(dǎo)表達的斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2。

一種由基因工程菌BL21(DE3)-pET-28a-prkacaa誘導(dǎo)表達的斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白作為抗原免疫動物研究的應(yīng)用或作為潛在靶點進行環(huán)境毒理學(xué)效應(yīng)分子機制研究。

一種制備斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白的方法，包括如下步驟：(1)斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白基因prkacaa的克隆，上游引物F(BamH I)為SEQ ID N0.3，下游引物R(Sal1)為SEQ ID NO.4；(2)重組表達載體pET-28a-prkacaa以及基因工程菌BL21(DE3) -pET-28a-prkacaa的構(gòu)建，將所述prkacaa基因與表達載體pET-28a(+)連接，構(gòu)建重組表達載體pET-28a-prkacaa，轉(zhuǎn)染BL21(DE3)感受態(tài)細胞，構(gòu)建基因工程菌BL21(DE3) -pET-28a-prkacaa；(3)基因工程菌的誘導(dǎo)表達，將所述的基因工程菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)；(4)斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白的純化，將誘導(dǎo)培養(yǎng)收集的菌體破碎，取上清液純化。

優(yōu)選的，所述的基因工程菌株用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)斑馬魚蛋白激酶Aα催化亞基蛋白表達的條件為37℃，180rpm條件下培養(yǎng)約2.5-3h至OD600＝0.6-0.8，加入終濃度為0.5 mM的IPTG在25℃，180rpm下誘導(dǎo)6h。

優(yōu)選的，所述菌體破碎取上清液的條件為以360w的功率冰浴超聲破碎菌體，超3s，間隔3s，共超聲20min，離心后沉淀重懸于PBS Buffer中，再次離心的上清液。