[發明專利]多肽的制備方法

有效

• 申請號: 202110554938.8
• 申請日: 2021-05-21
• 公開（公告）號: CN113025675B
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 洪浩;詹姆斯·蓋吉;肖毅;張娜;焦學成;趙軍旗;王磊;孟翔宇;張慕姣
• 申請（專利權）人: 凱萊英醫藥集團（天津）股份有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12P21/06;C07K14/605;C07K14/575;C07K14/635;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 金田蘊

本發明公開了一種多肽的制備方法。該制備方法包括以下步驟：構建Sumo標簽融合表達多肽基因的工程菌株，并誘導工程菌株可溶表達多肽；從工程菌株中純化得到含有多肽前體的粗蛋白；對含有多肽前體的粗蛋白采用Ulp1蛋白酶進行酶切，切除Sumo標簽；采用乙腈結合加熱沉淀的方法或采用六氟異丙醇沉淀的方法純化Ulp1蛋白酶的酶切產物，得到多肽。本發明建立了高效的基于可溶性重組表達藥用多肽或其前體的技術，建立了基于一步沉淀純化的簡單純化工藝，進一步的結合HPLC精制即可達到97%以上多肽純度。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體而言，涉及一種多肽的制備方法。

背景技術

多肽類藥物因其具有類似蛋白和小分子藥物雙重特性而備受關注，僅2015年多肽藥物的銷售就占據藥物市場的5%，達到500億美元，并且以每年9-10%的速度上漲，因此亟待建立高效的低成本的多肽合成和純化技術。多肽合成主要包括化學法、化學/酶法和生物法。其中，化學方法需要復雜的保護和脫保護過程，需要用到大量的有毒試劑，且可能產生消旋體；化學/生物法通常是用化學方法合成多肽，進一步通過特定的肽連接酶將多個肽段進行連接，工藝相對復雜，連接效率和特異性受到多肽序列的影響；生物法包括采用水解酶水解植物蛋白或動物蛋白然后提取獲得特定的有功能的多肽，但是通常產量較低，周期長，污染重，難實現工業化生產；另一種較為普遍的方法是重組表達，即采用基因工程的技術手段在原核或真核生物中引入目標基因表達元件，通過微生物發酵實現目標多肽的高效合成，然而由于多肽自身比較短，很難形成特定的空間結構，導致其非常容易被表達宿主的蛋白酶所降解，此外復雜的純化工藝又降低了產物收率，增加了成本。

目前，利用重組法生產的多肽包括多肽類抗生素、干擾素、利拉魯肽前體（GLP-1）和胰島素等，其中的GLP-1是由諾和諾德開發的用于治療II型糖尿病的多肽藥物，每年的銷售額達到數十億美元，其最初的合成方式是基于釀酒酵母分泌表達的工程菌株，然而由于其胞外蛋白酶的作用導致產物容易被降解，產量較低，敲除蛋白酶后表達的最高水平只有59 mg/L。畢赤酵母中融合表達GLP-1, 發酵5天的表達量只有26 mg/L。大腸桿菌作為一種常用的宿主，已被廣泛用于多肽的生物合成，然而同樣存在蛋白酶降解的風險，通過融合表達可以解決此類問題。目前GLP-1主要采用包涵體融合表達，如KSI標簽，內涵肽intein和信號肽-腸激酶酶切位點-GLP-1等，雖然包涵體表達量較高，可以避免蛋白酶降解，但復雜的變性和復性的過程要用到大量變性劑如尿素或鹽酸胍，純化工藝復雜導致最終得率非常低。同時為了將融合標簽完全去除通常需要用到腸激酶，該酶不僅難表達且會造成非特異切割。近來采用MFH融合標簽構建的包涵體表達，結合甲酸切割和變性條件下純化的工藝，避免了復性過程，但需用到尿素，進一步通過Tev蛋白酶切割獲得N端含有一個Gly的GLP-1，且Tev酶生物活性較低和產生非特異切割，生產步驟繁瑣，成本高。其他的融合標簽如GST，MBP，TrxA等多用作可溶表達的標簽，且一些肽經過這些標簽獲得了可溶表達，但是這些標簽的分子量相對某些目標肽來說都偏大，導致去除標簽后目標肽的得率偏低。此外GLP-1及其衍生物多呈聚合體狀態，純化需要在變性條件下進行，目前的純化步驟復雜，得率低下。

總的來說，現有技術主要存在以下問題：1）化學合成：工藝復雜，化學試劑有毒，可能產生消旋體，周期較長，產品的質量控制比較困難；2）包涵體表達：變復性純化工藝復雜，用到大量的尿素，切割過程中用到的腸激酶或Tev價格昂貴，易產生非特異性切割；復雜的變復性工藝導致純化過程非常復雜，得率降低；3）可溶表達：目前用到的可溶表達標簽主要包括TrxA，GST，MBP，在目標肽段和標簽需要加上酶切位點，常用到的酶通常難表達，且會造成非特異切割，沒有將Sumo標簽用于利拉魯肽前體融合表達的研究。

發明內容

本發明旨在提供一種多肽的制備方法，以解決現有技術中多肽純化步驟復雜、得率較低的技術問題。