[發明專利]促進砧木根系發育及抗旱的可移動miRNA及鑒定方法

有效

• 申請號: 202110550698.4
• 申請日: 2021-05-17
• 公開（公告）號: CN113430197B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 管清美;申小霞;毛秀山;平怡坤;李雪薇;樊天樂;張子桐
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84;A01H5/06;A01H5/00;A01H6/74;C12Q1/6895;C12Q1/6841;A01G2/30
• 代理公司: 西安長和專利代理有限公司 61227
• 代理人: 黃偉洪

本發明屬于生物技術和遺傳改良技術領域，公開了一種促進砧木根系發育及抗旱的可移動miRNA及鑒定方法，所述促進砧木根系發育及抗旱的可移動miRNA是蘋果中的Mdm?miR160；所述促進砧木根系發育及抗旱的可移動miRNA的鑒定方法包括：RNA提取和反轉錄；基因克隆；蘋果遺傳轉化；干旱脅迫處理；原位雜交；微嫁接；煙草嫁接番茄；數據分析。本發明提供的促進砧木根系發育及抗旱的可移動miRNA是蘋果中的Mdm?miR160，可以從接穗移動到砧木，促進砧木的根系發育，從而提高蘋果的抗旱性。本發明通過蘋果遺傳轉化，獲得過量表達的轉基因株系，表型分析發現，Mdm?miR160e OE表現出矮化癥狀。

技術領域

本發明屬于生物技術和遺傳改良技術領域，尤其涉及一種促進砧木根系發育及抗旱的可移動miRNA及鑒定方法。

背景技術

目前，植物已經進化出動態和復雜的細胞間通訊網絡，協調和適應它們的生長和發育以適應各種環境變化。除了蛋白質和RNA等大分子外，代謝產物和植物激素等小分子也在植物中起信號傳遞的作用。作為信號分子RNA可以通過胞間連絲在細胞間局部移動，也可以通過韌皮部長距離移動來發揮生物學功能。非細胞自主RNA可作為植物生長發育、營養分配、基因沉默、抗病毒防御和脅迫響應等多種生理過程的移動信號，對植物體內的潛在調控機制具有重要的生物學意義。

miRNAs是一類內源性的非編碼調節RNA，由RNA聚合酶II轉錄產生初級miRNAs(pri-miRNAs)。在植物中通過DICER-LIKE 1(DCL1)剪切處理大多數的pri-miRNAs，隨后相互作用蛋白SE、HYL1和CBC剪切pri-miRNA形成短的雙鏈miRNA，包括一個成熟miRNA和一個信使miRNA鏈，大約20-24個核苷酸長度。研究表明成熟的miRNAs通過形成RNA誘導的沉默復合體與靶標mRNA結合，從而對靶基因起到負調控作用。在擬南芥中，miR160的靶基因是生長素反應因子(ARF10、ARF16和ARF17)，共同調控植物的生長發育多個方面。然而蘋果Mdm-miR160介導的ARF17在干旱響應中的功能尚未有研究報道。因此本發明通過遺傳轉化獲得了蘋果Mdm-miR160e的轉基因株系，并對Mdm-miR160介導的蘋果抗旱性進行了深入的研究。

研究報道一些miRNAs可以作為細胞間信號，進行短距離移動或長距離移動。有一些miRNAs可以在植物內部發生運動，這些miRNAs主要集中在韌皮部的分泌物中，通過營養物質的有效傳遞進行長距離的移動。但現有技術中關于miRNA移動后促進砧木根系發育及抗旱的相關技術方案尚未見報道。

嫁接是研究miRNA移動的主要手段。目前嫁接已被廣泛應用于促進蘋果的開花、矮化和抗逆等方面。因此，亟需一種促進砧木根系發育及抗旱的基因及鑒定方法。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：一，現有技術大部分是通過嫁接后韌皮部汁液測序分析、原位雜交、stem-loop RT-qPCR，突變體篩選以及Northern blot等方法研究miRNA的移動，以上實驗可以發掘新的可移動miRNAs，但miRNAs移動后發揮的生物學功能研究報道較少。二，miRNA在加工生成過程中會發生兩次剪切，因此不能連接熒光標簽(如GFP)準確可視化miRNAs的移動過程。三，異源物種嫁接成功率較低，并且miRNA家族在不同的物種間十分保守，這給miRNA移動的實驗驗證帶來不便。

解決以上問題及缺陷的難度為：miRNA與水分子和其他離子不同，在組織間的運輸不是循環進行的，因此需要更多的實驗來確定可移動的物種和決定一個miRNA是否可移動的特征。miRNAs隨著韌皮部汁液的運輸而發生移動，驗證miRNA及其活性的動態可視化方法對于提供miRNA移動的最終證據至關重要，還需要進一步探索和創新。miRNA介導的細胞和器官間的信號轉導機制和調控機制研究較少。為了充分理解可移動miRNA的作用，確定不同家族成員的表達模式、定位和功能，以及闡明不同家族成員是否具有不同的移動性需要更多的研究支持。