[發明專利]用于植物應激顆粒相關蛋白快速鑒定的Gateway雙元質粒載體、其構建方法及應用

有效

• 申請號: 202110548048.6
• 申請日: 2021-05-19
• 公開（公告）號: CN113281521B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 胡筑兵;吳承云;王曉慶;劉巧巧;聶亞晴
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明屬于作物基因工程領域，具體涉及用于植物應激顆粒相關蛋白快速鑒定的Gateway雙元質粒載體、其構建方法及應用。該載體包含PAB2表達框（序列如SEQ ID NO.1第27至3954位所示）、Super?GW?GFP?3Flag表達框（序列如SEQ ID No.1第3973至7869位所示）和除草劑Basta抗性基因表達框（序列如SEQ ID NO.1第14581至15729位所示）。本發明還提供了利用所述質粒載體構建的重組載體，及其在煙草葉片和模式植物擬南芥中的應用。本發明的質粒載體能夠快速、高效的鑒定目標蛋白是否為應激顆粒組分，并且能夠成功獲得雙熒光定位的穩定表達轉基因植株。

技術領域

本發明屬于作物基因工程領域， 具體涉及用于植物應激顆粒相關蛋白快速鑒定的Gateway雙元質粒載體、其構建方法及應用。

背景技術

全球氣候變暖致使高溫天氣頻繁發生，嚴重影響植物的生長發育，使農作物嚴重減產。高溫已經成為影響植物生長發育的重要環境因子，分析植物對高溫的耐性機制，成為當前亟待解決的科學問題。目前關于植物對高溫耐性機制主要集中于熱激轉錄因子的轉錄激活方面。然而，基因轉錄水平的變化比其迅速應對逆境脅迫壓力所需的時間更長。為了應對這一挑戰，植物細胞已進化出另一種保護機制—形成應激顆粒（stress granule）。

應激顆粒的形成是一種重要的轉錄后和翻譯調控機制，當真核細胞受到外界脅迫刺激時，在細胞質中形成一種由翻譯起始因子、mRNAs、Poly(A)結合蛋白和RNA結合蛋白等組成的無包膜包被致密顆粒物即應激顆粒。在哺乳動物和酵母細胞中，應激顆粒的形成與神經退行性疾病、癌細胞死亡、病毒感染、免疫反應、細胞凋亡和炎癥反應等密切相關。有研究顯示植物細胞應激顆粒的形成，會增強植物對高溫敏感性，暗示應激顆粒的形成對于植物適應高溫逆境具有非常重要的作用。但是，植物中應激顆粒的形成機制、組分以及生物學功能仍知之甚少。

應激顆粒的形成作為細胞抵御外界不利條件，使細胞應激期間的損傷降至最低的一種保護性途徑，這一途徑會觸發將導致大多數mRNAs的翻譯受到抑制，而應激解除時被應激顆粒保護的mRNAs又能夠被釋放并進行翻譯，這種翻譯重編程允許細胞保存能量及維持細胞內穩態。目前，在哺乳動物和酵母細胞中，應激顆粒的組分及生物學功能已有大量報道，但其在植物中的研究仍然較少，而且目前沒有能夠快速、高通量地鑒定和分析植物應激顆粒蛋白的雙元質粒載體。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種應激顆?？焖?、高效、高通量分析的雙元Gateway雙元質粒載體pSGRB7FWG2，為加速植物應激顆粒的研究提供強有力的工具。

本發明的第一個方面，提供用于植物應激顆粒相關蛋白快速鑒定的Gateway雙元質粒載體，所述質粒載體為pSGRB7FWG2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步的，所述載體包含PAB2表達框、Super-GW-GFP-3Flag表達框和除草劑Basta抗性基因表達框，所述PAB2表達框的核苷酸序列如SEQ ID No.1第27至3954位所示；所述Super-GW-GFP-3Flag表達框的核苷酸序列如SEQ ID No.1第3973至7869位所示；所述除草劑Basta抗性基因表達框的核苷酸序列如SEQ ID No.1第14581至15729位所示。

更進一步的，所述PAB2表達框包括：35S啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第2927至3954位所示；PAB2基因，其核苷酸序列如Seq ID No .1第986至2872位所示；紅色熒光蛋白RFP編碼序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第274至952位所示；以及T35S終止子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1第27至252位所示；