[發明專利]一種培育不結球白菜小孢子植株的方法

在審

• 申請號: 202110547044.6
• 申請日: 2021-05-19
• 公開（公告）號: CN113080065A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 李英;蔣林鈁;侯喜林;王建軍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 競存;徐冬濤

本發明公開了一種培育不結球白菜小孢子植株的方法。該方法包括如下步驟：(1)取樣及花蕾挑選；(2)小孢子培育：用次氯酸鈉對花蕾消毒，滅菌水清洗2遍，1/2NLN?13培養基潤洗；潤洗后的花蕾進行研磨、過濾、離心，黃綠色沉淀用NLN?13培養基稀釋并添加活性炭，加入褪黑素分裝到35mm培養皿，33℃熱激24h，暗培養10天形成胚狀體；(3)植株再生：胚狀體補光振蕩培養后移到改良固體1/2MS培養基中培育50d，煉苗移栽。本發明所述方法在能夠誘導部分難出胚品種出胚，提高易出胚品種出胚率，簡化操作步驟縮短試驗時間，提高再生植株存活率。

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及一種培育不結球白菜小孢子植株的方法。

背景技術

不結球白菜(Brassica campestris ssp.chinensisMakino)常被稱為小白菜，為十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)，其口感好、食用價值高、生長周期短、適應性強，在我國各地均有種植，是我國重要的蔬菜作物之一。不結球白菜為常異花授粉作物，通過優良親本雜交獲得雜種優勢的品系是常見的育種方法之一，因此如何獲得穩定的純合親本對于不結球白菜種質創新工作意義重大。

游離小孢子培養技術(Isolated Microspore Culture，IMC)是指通過機械擠壓花蕾的方式，分離小孢子，利用細胞全能性，培養成單個植株的過程。游離小孢子培養技術從培養到雙單倍體(Doubled Haploid，DH)植株的獲得僅需1～2年，大幅提升育種工作的效率。

1982年，德國科學家Lichter從甘藍型油菜的花蕾中分離出小孢子，通過培養最終獲得胚狀體，為蕓薹屬作物游離小孢子技術發展奠定基礎。之后，游離小孢子培養技術在青花菜、菜薹、菜心等蕓薹屬作物相繼獲得成功，這項技術日益成熟，逐漸發展成一套較為完善的體系。除蕓薹屬作物之外，游離小孢子培養技術在辣椒、蘿卜、黃瓜、茄子等蔬菜作物以及玉米、水稻、小麥、大麥等糧食作物上也取得重大突破。國內研究游離小孢子培養雖然起步較晚，但是經過科研工作者的努力，已經取得顯著的成果。1992年，曹鳴慶等首次對12個小白菜品種進行游離小孢子培養試驗，一共有9個品種獲得胚狀體及再生植株。1993年，李巖等以小白菜的三個變種為試驗材料，成功獲得胚狀體及其再生植株。隨著國內外對游離小孢子培養技術研究的不斷深入，已經初步建立了一些有效的小孢子培養體系。但小孢子胚胎發生機理尚不清楚，影響因素復雜，出胚率受基因型制約嚴重，污染問題一直存在。

發明內容

本發明主要是針對目前該技術操作繁瑣，出胚率受基因型影響以及污染等問題進行改進，從而提供了一種高效簡易的培育不結球白菜小孢子植株的方法。

本發明采取的技術方案如下：

一種培育不結球白菜小孢子植株的方法，其特征在于具體包括如下步驟

(1)取樣：在不結球白菜的盛花期，摘取不結球白菜花序，加入少量的無菌水保持花蕾濕潤，放入4℃冰箱進行低溫預處理24h；

(2)挑蕾：用鑷子挑選不結球白菜的花蕾，從步驟(1)預處理后的花序中挑選飽滿、無病蟲害且長度在2～3mm之間的花蕾，放置于離心管中；

(3)花蕾消毒：向離心管中加入質量濃度為1％的NaClO溶液，震蕩，棄去NaClO溶液，加入無菌水清洗，棄去無菌水，用1/2NLN-13培養基潤洗；

(4)小孢子分離及純化：取步驟(3)消毒后的花蕾加入1/2NLN-13培養基，研磨，過濾，離心，棄上清液，下層產物待用；

(5)小孢子稀釋及分裝：將步驟(4)所得下層產物用NLN-13培養基稀釋，使混合液中小孢子濃度為1×10⁵～2×10⁵個/mL，優選的，使混合液中小孢子濃度為1×10⁵；

向混合液中加入活性炭溶液，使混合液中活性炭終濃度為1mg/mL；