[發(fā)明專利]一種腦脊液類器官的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110544021.X
• 申請(qǐng)日: 2021-05-19
• 公開（公告）號(hào): CN113249319B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫曉嬌;張亮仁;劉振明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/078
• 分類號(hào): C12N5/078;C12N5/09
• 代理公司: 北京細(xì)軟智谷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11471
• 代理人: 劉靜培

1.一種腦脊循環(huán)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：

（1）將細(xì)胞捕獲濾膜置于無水乙醇溶液中進(jìn)行浸洗，確保所述細(xì)胞捕獲濾膜完全浸潤；

（2）采用1×PBS完全浸潤并洗滌所述細(xì)胞捕獲濾膜，保證殘余乙醇徹底去除；

（3）截留細(xì)胞富集：將腦脊液加入到PBS中進(jìn)行稀釋，采用步驟（2）洗滌過的所述細(xì)胞捕獲濾膜對(duì)稀釋后的所述腦脊液進(jìn)行過濾，然后采用HBSS緩沖液對(duì)所述細(xì)胞捕獲濾膜進(jìn)行多次洗滌，至膜上無可見殘留物；

（4）無菌鑷子夾取步驟（3）的所述細(xì)胞捕獲濾膜，置于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，形成腦脊液循環(huán)腫瘤細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)混合液；將所述腦脊液循環(huán)腫瘤細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)混合液進(jìn)行離心，棄上清液，得到重懸腦脊液循環(huán)腫瘤細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)混合液，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：DMEM/F12培養(yǎng)液中添加1% 1×Glutamax，10 mM HEPES緩沖液，100U/ml 青霉素，0.1mg/ml鏈霉素，1.5% 生長因子B27 supplement，1% 生長因子N2 supplement，50ng/ml生長因子EGF，100 ng/ml生長因子FGF-10， 1μg/ml生長因子IGF1， 0.2%的抗生素primocin，10 uM抑制劑SB431542，1%MEM-NEAA和1ug/ml Heparin50；

（5）將分化培養(yǎng)基重懸備用；將溫和細(xì)胞解離試劑和含有15 mM HEPES的DMEM/F-12置于冰上備用；冰上解凍Matrigel備用；將低黏附培養(yǎng)皿進(jìn)行預(yù)熱；所述分化培養(yǎng)基為：由50%DMEM/F12培養(yǎng)液和50% Neurobasal培養(yǎng)基組成混合培養(yǎng)基，在所述混合培養(yǎng)基中添加0.5%生長因子N2 supplement，1%生長因子B27 supplement，3.5ul/L 2-mercaptoethanol，0.025% insulin，1% 1×Glutamax，0.5% MEM-NEAA和10 μM Y-27632；

（6）先向每個(gè)預(yù)熱后的低黏附培養(yǎng)皿中加入重懸后的所述分化培養(yǎng)基；再將解凍后的Matrigel和步驟（4）得到的所述重懸腦脊液循環(huán)腫瘤細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)混合液加入到所述低黏附培養(yǎng)皿中，混合均勻，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（1）中，將細(xì)胞捕獲濾膜置于1-2mL 75%的乙醇溶液中進(jìn)行浸洗，重復(fù)3次以上，確保所述細(xì)胞捕獲濾膜完全浸潤。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞捕獲濾膜的孔徑為8μm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（2）中，采用1×PBS完全浸潤并洗滌所述細(xì)胞捕獲濾膜5次以上，保證殘余乙醇徹底去除。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（3）中，將腦脊液沿模具內(nèi)壁緩慢加入到PBS中以質(zhì)量比為1：1的比例進(jìn)行稀釋，采用洗滌過的所述細(xì)胞捕獲濾膜對(duì)稀釋后的所述腦脊液進(jìn)行捕獲。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（4）中，所述細(xì)胞捕獲濾膜置于所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，每3-5天換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為11-15天。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟（5）中，所述預(yù)熱具體為：將所述低黏附培養(yǎng)皿置于37℃孵箱預(yù)熱30分鐘。