[發明專利]一種珊瑚共生菌的回接和示蹤方法

在審

• 申請號: 202110541350.9
• 申請日: 2021-05-18
• 公開（公告）號: CN113303247A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 李潔;鄒易陽;張偲
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: A01K61/00
• 分類號: A01K61/00;G01N21/64
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了一種珊瑚共生菌的回接和示蹤方法。將珊瑚有益菌用熒光染料標記，然后將熒光染料標記的細菌回接至珊瑚個體中。本發明使用的熒光染料及回接器材均為商業成品，熒光染料標記步驟簡單，標記所用材料及設備容易獲得，而且可以追蹤回接菌體被珊瑚宿主自身吸收。利用該技術可以快速簡便地將有益菌回接至珊瑚宿主當中。

技術領域：

本發明屬于微生物領域，具體涉及一種珊瑚共生菌的回接和示蹤方法。

背景技術：

珊瑚礁生態系統作為地球上擁有悠久進化歷史的一類生態系統，因其擁有極高的初級生產力、豐富的生物多樣性以及重要的經濟和生態價值，–近年來成為海洋生態系統的研究熱點。珊瑚共生體中蘊含豐富的微生物資源，根據不同細菌種群在珊瑚中的作用，有學者提出了珊瑚有益微生物的概念(Beneficial Microorganisms for Corals,BMC)。BMC是指能夠維系和保護珊瑚生理平衡狀態的微生物，通過回接有益菌可提高珊瑚對脅迫環境的耐受能力、促進生長發育、維護珊瑚健康。因此，需要一種高效、穩定且無害化的技術，能夠實現將有益菌回接進入珊瑚體內的目的。

細菌回接技術被廣泛應用于微生物研究領域，主要涉及提高農業的質量、數量和可持續性，防治農業害蟲以及促進植物生長中。而對于珊瑚宿主而言，也有通過生物添加技術對抗環境脅迫的成功事例。雖然該項技術在農業和生物修復領域有著廣泛應用，但其在海洋生態系統中的應用范圍和應用對象仍有較大的挖掘空間。

現有的珊瑚來源細菌回接技術中，有采用浸沒法，即通過菌液浸沒珊瑚斷枝達到回接細菌的目的。也有其他方法，如Assis等人使用輪蟲作為細菌載體，將其與益生菌同時投放至珊瑚養殖環境中以達到回接目的；Sivakunmar等人在2014年也提出可以使用海藻酸鹽來封裝益生菌，從而實現一種有效且環境友好的細菌回接方式。

回接的效率和成本對于開展研究及應用至關重要。但是現階段提出的幾種回接技術都有相同的弊端，它們對于細菌細胞是否進入珊瑚體內以及回接技術這一操作本身是否對于珊瑚宿主產生不良影響并無直接證據。同時，通過浸潤菌液的回接技術在經濟效益上并不值得大規模實施，無法快速高效地完成細菌回接過程。

發明內容：

本發明的目的是提供一種高效穩定，且對珊瑚宿主無影響的珊瑚共生菌的回接方法，可實現細菌回接至珊瑚后的示蹤及定位。

本發明的珊瑚共生菌的回接方法，包括以下步驟：

將珊瑚有益菌用熒光染料標記，然后將熒光染料標記的細菌回接至珊瑚個體中。

所述的熒光染料可以為5,6-羧基四甲基羅丹明琥珀酰亞胺酯(5,6-TAMRA-SE)(品牌：賽默飛，貨號：C1171)。

所述的回接是將熒光染料標記的細菌菌液澆淋珊瑚斷枝，然后共培養。

所述的珊瑚有益菌可以是珊瑚共生細菌。

所述的珊瑚共生細菌可以是選取從珊瑚組織中分離培養得到的細菌菌種進行培養，然后離心收集細菌細胞，再重懸。

所述的培養是培養到對數生長期。

所述的將珊瑚有益菌用熒光染料標記是在細菌菌液中添加熒光染料。

所述的熒光染料在細菌菌液中的濃度為150μmol/L。

本發明通過顯微觀察技術，檢驗帶有熒光標記的細菌是否經由回接技術被珊瑚宿主吸收。

本發明的第二目的是提供一種對于熒光染料標記的細菌回接珊瑚宿主后，對回接細菌定植情況的檢驗方法，包括以下步驟：在接受回接操作后，取珊瑚斷枝樣品進行熒光顯微觀察，在標記菌特有的熒光信號及珊瑚自身熒光信號下，觀察回接操作是否將細菌回接至珊瑚體內。