[發明專利]一種藍藻氣囊提取方法及其應用

有效

• 申請號: 202110531707.5
• 申請日: 2021-05-17
• 公開（公告）號: CN113186134B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 許瑞;龍歡;黃開耀
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A61K49/22;C12R1/89
• 代理公司: 湖北創融藍圖知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42276
• 代理人: 羊淑梅

本發明屬于生物醫學技術領域，尤其涉及一種藍藻氣囊提取方法及其應用。本申請建立了一個快速、高效提取微囊藻氣囊的方法(“H₂O₂法”)。具體步驟包括：S1：調整藻細胞濃度為(0.5?8.0)×10⁷個/mL；S2：加入0.02?3.5mol/L的過氧化氫；S3：搖晃處理5?240min；S4：將處理后的藻液低溫離心；S5：取離心后的上層白色乳狀物與PBS溶液等比例混合，低溫離心，保留白色漂浮層即為氣囊。該技術為進一步開發生物合成的超聲造影劑提供了技術支撐，展現出較好的工業潛力，同時也對研究氣囊的精細結構提供了原材料。

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，尤其涉及一種藍藻氣囊提取方法及其應用。

背景技術

超聲成像作為臨床診斷和生物學研究的常用手段，具有高時空分辨率、深穿透性和低成 本等優點，特別是超聲造影劑的靶向修飾可在分子水平上無創顯示血栓、炎癥及腫瘤血管， 進行靶向檢測和治療，拓寬了傳統成像模式的診斷能力和實用性。除了超聲診斷外，攜帶藥 物的微泡造影劑在受到低強度的超聲輻射時，發生爆破并釋放藥物，其發生的空化效應使附 近的毛細血管和細胞通透性增高，提高了相應組織對藥物的攝取率。因而，超聲造影劑在腦 部、心血管和癌癥等重大疾病的檢測和治療中具有重要的應用前景。

目前，臨床上使用較多的造影劑是人工合成的由脂質、聚合物或蛋白外殼包裹氣體的直 徑為幾微米(1-8μm)的微泡。因其體積較大，只能在血管內成像，無法穿過血管壁進入非 血管腫瘤部位。因此這類微泡在生物醫學上的應用受到了限制，同時還存在生物安全性的問 題。

最近的研究發現，來源于藍藻和古菌內的氣囊能顯著增強超聲成像的效果，使其具有作 為納米級超聲造影劑的潛質。氣囊是由蛋白質外殼包裹氣體形成的中空紡錘體狀或圓柱體狀 結構，長度為200nm-2000nm，直徑為45nm–200nm。因氣囊內部氣體和周圍介質之間的 聲阻抗不同使得氣囊能夠散射聲波，產生諧波信號，可以顯著增強含氣囊區域的對比度，并 提供可區分的超聲信號。由于其納米級尺寸和諧波產生能力，使氣囊在腫瘤成像中展現出巨 大的潛力。

氣囊主要存在于藍藻和古菌中，目前研究發現參與氣囊形成的基因有gvpA₁A₂A₃CNKJKFGWV，其中Gvp A和Gvp C是形成氣囊的主要結構組成蛋白。Gvp A具有 很強的疏水性，在氣囊壁上形成間距為4.6nm的棱紋結構。Gvp C位于氣囊的外表面，與Gvp A相互作用增強氣囊壁的強度。其他相關蛋白功能未知。為了將氣囊廣泛應用于臨床研究中，2018年Shapiro團隊通過基因工程的方法將表達氣囊的基因簇(ARG1)密碼子優化后在大腸桿菌中表達，發現這些表達氣囊的大腸桿菌也具有超聲造影屬性。隨后,他們在腸道益生菌ECN(E.coli strain Nissle 1917)中表達了ARGs,來驗證表達ARGs的細胞在體內的可檢測性， 實現了活體微生物超聲成像。另外，Farhadi等采用多質粒共轉染系統，將mARGs(哺乳動 物聲學報告基因，包括來自于巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium的gvpBNFGLSKJU)穩定表 達于HEK-293T人體腎臟細胞，成功表達了氣囊。隨后將上述HEK細胞注射于免疫缺陷小鼠 腿部構建腫瘤模型。結果顯示在超聲成像下，報告基因的信號可清晰地勾勒出腫瘤組織的輪 廓。這說明作為一種新型的超聲造影劑，氣囊為超聲分子成像和疾病檢測提供了新的技術手 段。

除上述在異源細胞中表達氣囊的操縱子獲得氣囊以外，另一種策略是直接從藍藻或古菌 中提取氣囊，直接或修飾后進行超聲成像。因藻類易于培養，且氣囊含量豐富，是理想的氣 囊制備原料。現有的從藍藻中提取氣囊的方法包括：

2017年，《微生物學通報》公開了一種水華藍藻氣囊的分離純化方法：這里稱為“高滲 裂解法”，具體步驟為：