[發(fā)明專利]美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種ELISA檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110528830.1
• 申請(qǐng)日: 2021-05-14
• 公開（公告）號(hào): CN113281506A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張正;于永翔;王麗芳;王印庚;羅展;王學(xué)波;李永杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/543;G01N33/58
• 代理公司: 北京開陽(yáng)星知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11710
• 代理人: 姚金金

1.美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包括以美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種滅活菌液抗原制備的雞血清抗體樣本。

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括包被緩沖液、洗滌緩沖液、5％脫脂奶粉液、BSA稀釋液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗雞抗體、山羊源抗體專用稀釋液、四甲基聯(lián)苯胺底物顯色液、終止液。

3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述抗原為用甲醛溶液制備濃度大于1.0×10⁹cfu/ml的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種滅活菌液。

4.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述抗原的制備步驟如下：

(1-1)活化菌體：將保存的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌種接種于TSB瓊脂平板培養(yǎng)基上；

(1-2)制備種子液：挑取單菌落接種于少量TSB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)；

(1-3)擴(kuò)大培養(yǎng)：取少量種子液接種于TSB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)；

(1-4)滅活：離心后獲取菌體沉淀，加入含有0.5％甲醛的PBS溶液重懸至原來(lái)的體積；

(1-5)滅活檢驗(yàn)：取滅活后的菌液涂布于TSB瓊脂平板培養(yǎng)基上檢驗(yàn)是否滅活合格。

5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的雞抗血清樣本的制備步驟如下：

(2-1)將滅活菌液與佐劑按3:7的體積比混合后乳化制成免疫用疫苗；

(2-2)用(2-1)中制成的疫苗分4次免疫健康SPF雞；

(2-3)待第4次免疫結(jié)束后適時(shí)采集雞血，制備血清，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于檢測(cè)時(shí)包括以下步驟：

(1)將美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種滅活菌液在液氮和溫水浴之間反復(fù)凍融，破碎菌體；

(2)用包被緩沖液將滅活菌液稀釋至l0⁷ CFU/mL，橫向包被酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃包被2h；

(3)傾去孔中液體，在吸水紙上拍干，加入100μL洗滌液沖洗酶標(biāo)板，在吸水紙上拍干，如此反復(fù)洗滌3次；

(4)加入5％脫脂奶粉，300μL/孔，37℃封閉2h，洗滌3次；

(5)加入100μL BSA稀釋液稀釋的抗血清，37℃溫育1h，每次都需加稀釋液的對(duì)照組血清設(shè)立陰性對(duì)照和不加一抗的空白對(duì)照，洗滌3次；最后一次停留5min；

(6)用山羊源抗體專用稀釋液將酶標(biāo)二抗稀釋8000倍，100μL/孔，37℃溫育1h，洗滌3次；

(7)加入100μL底物顯色液，室溫避光顯色10min；

(8)每孔加入100uL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)取OD₄₅₀。

7.美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的ELISA檢測(cè)試劑盒在間接ELISA方法檢測(cè)美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種中的應(yīng)用。