[發(fā)明專利]核酸分子、PCR引物對(duì)及用于檢測(cè)禽毛滴蟲β-tubulin基因的試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110527892.0
• 申請(qǐng)日: 2021-05-14
• 公開（公告）號(hào): CN113136438B
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡海明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 戴志攀

本發(fā)明公開了一種核酸分子、PCR引物對(duì)及用于檢測(cè)禽毛滴蟲β?tubulin基因的試劑盒。發(fā)明人通過廣泛研究，在禽毛滴蟲中克隆得到如SEQ?ID?NO:1所示的禽毛滴蟲β?tubulin全長基因編碼序列，并利用該β?tubulin全長基因編碼序列進(jìn)一步設(shè)計(jì)得到能夠檢測(cè)禽毛滴蟲β?tubulin基因及其轉(zhuǎn)錄水平的PCR引物對(duì)和相應(yīng)的PCR反應(yīng)條件，進(jìn)而組裝成用于檢測(cè)禽毛滴蟲β?tubulin基因的試劑盒，從而可以滿足寄生生物學(xué)、生命科學(xué)研究者的檢測(cè)需要，以及促進(jìn)對(duì)該病原的基因水平檢測(cè)及其致病機(jī)制的研究進(jìn)展，為基因功能研究和藥物開發(fā)等研究工作提供有利技術(shù)支撐。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種核酸分子、PCR引物對(duì)及用于檢測(cè)禽毛滴蟲β-tubulin基因的試劑盒。

背景技術(shù)

我國養(yǎng)鴿歷史悠久，將鴿子作為商品生產(chǎn)也有100多年歷史，現(xiàn)階段肉鴿養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)遍布我國各個(gè)地區(qū)，并且規(guī)模不斷壯大，鴿感染性疾病的有效防控也越發(fā)重要。其中，鴿毛滴蟲病(又稱“鴿癀”)也是養(yǎng)鴿場(chǎng)高發(fā)的消耗性寄生蟲病，對(duì)肉鴿生產(chǎn)性能和幼鴿存活率均具有重要危害性。最常見的特征變化是口腔和咽喉黏膜形成粗糙鈕扣狀的黃色沉著物；濕潤者，稱為濕性潰瘍；呈干酪樣或痂塊狀則稱為干性潰瘍。臍部感染時(shí)，皮下形成腫塊，呈干酪樣或潰瘍性病變；波及內(nèi)臟器官時(shí)，便引起黃色粗糙界線明顯的干酪樣病灶，結(jié)果導(dǎo)致實(shí)質(zhì)器官組織壞死。病鴿因口腔潰瘍而妨害采食，在幼鴿和生長期鴿中可引起很高的死亡率。鴿毛滴蟲病的病原是禽毛滴蟲，屬鞭毛亞門，動(dòng)鞭毛綱，多鞭毛目，毛滴蟲科，毛滴蟲屬。實(shí)驗(yàn)室診斷一般通過顯微鏡檢查口腔、食道、嗉囊分泌物涂片發(fā)現(xiàn)蟲體，或刮取病變處黏液制成涂片，染色鏡檢見到典型蟲體。禽毛滴蟲蟲體呈瓜子形或梨形，蟲體前端有毛基體伸出4根鞭毛，使蟲體可迅速移動(dòng)。在蟲體的一側(cè)有波動(dòng)膜，其起始于蟲體的前端，終止于蟲體稍后方蟲體前部有1橢圓形的核，蟲體前部與波動(dòng)膜相對(duì)，一側(cè)有胞口，蟲體中央有一根細(xì)長的軸柱自前向后伸延至蟲體后緣之外。蟲體憑借在體液中作螺旋式運(yùn)動(dòng)，以分裂方式增殖，約4小時(shí)便可增殖一世代。目前對(duì)于該病原的致病機(jī)制研究仍很少，究其原因，在于缺乏有效的基因水平檢測(cè)手段。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。其中，熒光定量PCR是一種常見的核酸定量技術(shù)，也是低成本，重復(fù)性高，便于操作的基因水平檢測(cè)手段。該技術(shù)在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中引入了SYBR、TB?Green等核酸熒光標(biāo)記物質(zhì)，通過檢測(cè)每個(gè)熱循環(huán)后PCR反應(yīng)體系中的熒光值的增加情況，進(jìn)而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR的擴(kuò)增情況，并擬合出每個(gè)樣本的熒光定量變化曲線，從而獲得每個(gè)反應(yīng)管的Ct值(熒光變化達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)數(shù))，以起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和各個(gè)標(biāo)本的Ct值對(duì)每個(gè)反應(yīng)的起始DNA模板數(shù)進(jìn)行定量測(cè)定。

β-tubulin蛋白是細(xì)胞骨架的主要組成部分，對(duì)寄生蟲增殖、形態(tài)變化和黏附宿主上皮細(xì)胞均具有重要作用。因此，β-tubulin基因及其轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)，可以為基因功能研究和藥物開發(fā)等研究工作提供有利技術(shù)支撐。

但是，禽毛滴蟲的β-tubulin基因沒有任何研究報(bào)道，這阻礙了對(duì)該病原的基因水平檢測(cè)及其致病機(jī)制的研究進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，有必要提供一種展示禽毛滴蟲的β-tubulin全長基因編碼序列的核酸分子。

一種核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

本發(fā)明還提供了一種PCR引物對(duì)，所述PCR引物對(duì)能夠通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)如上所述的核酸分子。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示的下游引物，或核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ?ID?NO:5所示的下游引物。

本發(fā)明還提供了一種重組載體，所述重組載體含有如上所述的核酸分子。