[發(fā)明專利]一種具有群體淬滅活性的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法、應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110523054.6
• 申請(qǐng)日: 2021-05-13
• 公開（公告）號(hào): CN113416682A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓笑笑;柳鵬福;儲(chǔ)消和;陳艷;謝賽雪;陳天德
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/75;C12N15/55;C12N9/18;A01N63/22;A01P1/00;C12R1/125
• 代理公司: 杭州杭誠(chéng)專利事務(wù)所有限公司 33109
• 代理人: 薄盈盈

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有群體淬滅活性的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其應(yīng)用，所述構(gòu)建方法為將酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶編碼基因克隆到枯草芽孢桿菌表達(dá)載體上，去掉載體上調(diào)控蛋白編碼基因lacI，再轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，得到具有群體淬滅活性的枯草芽孢桿菌基因工程菌。本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)AHL內(nèi)酯酶的重組枯草芽孢桿菌，不需要額外添加誘導(dǎo)劑就能持續(xù)性表達(dá)高活性的群體感應(yīng)淬滅酶AhlX，所用的宿主為環(huán)境友好型的枯草芽孢桿菌，在防治植物細(xì)菌性病害方面有著天然的優(yōu)勢(shì)，與化學(xué)農(nóng)藥相比無污染，無毒害，無殘留，對(duì)環(huán)境無傷害，是一個(gè)綠色防控措施，在防治細(xì)菌性病害方面具有很大的潛力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有群體淬滅活性的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物軟腐病是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)引起的植物病害，歐文氏菌能夠侵染植物組織或器官，使植物出現(xiàn)大面積的腐爛，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大危害。目前對(duì)植物軟腐病的防治方法有合理輪作、避免機(jī)械損傷、噴灑農(nóng)藥或植物水提液等，這些方法不僅增加了人力消耗，還會(huì)造成環(huán)境污染、危害人體健康。因此，新型環(huán)境友好型的病害防治策略亟需研究和開發(fā)。

群體感應(yīng)(Quorum Sensing，QS)是指細(xì)菌通過感知自身所分泌的化學(xué)信號(hào)分子濃度，調(diào)控特定基因的表達(dá)，并協(xié)調(diào)細(xì)菌的一系列生物學(xué)行為的現(xiàn)象。在致病菌歐文氏菌(E.carotovora)中，同樣存在這種群體感應(yīng)現(xiàn)象，歐文氏菌通過分泌酰基高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子(AHLs)，調(diào)控一些致病因子的表達(dá)，從而引起植物軟腐病的發(fā)生。

群體淬滅(Quorum Quenching，QQ)通過抑制或干擾生物細(xì)胞間QS系統(tǒng)，阻斷細(xì)胞間的“信息交流”，從而防御致病菌感染，因此被視為一種綠色環(huán)保型病害防治策略。其作為一種新型環(huán)境友好型的病害防治策略，能夠有效抑制病原菌的致病性，并且不會(huì)引起細(xì)菌抗藥性。

AhlX是一種金屬-β-內(nèi)酰胺類酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶，它能夠水解AHLs信號(hào)分子的內(nèi)酯環(huán)，從而起到降解信號(hào)分子的作用，其擁有獨(dú)特的耐鹽能力、熱穩(wěn)定性。

枯草芽孢桿菌B.subtilis 168是一種優(yōu)良的生防菌，在環(huán)境中廣泛存在，對(duì)人畜無害，在食品、飼料和農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用廣泛。目前，枯草芽孢桿菌本身作為一種生防菌已應(yīng)用于植物病害的生物防治。

將AHL內(nèi)酯酶表達(dá)在枯草芽孢桿菌B.subtilis 168中，可以集中二者的優(yōu)勢(shì)，有望代替化學(xué)農(nóng)藥，有效抑制植物軟腐病的發(fā)生，符合“健康、綠色”的生活理念。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，提供了一種具有群體淬滅活性的枯草芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明還提供了一種由上述構(gòu)建方法得到的具有群體淬滅活性的枯草芽孢桿菌基因工程菌。

本發(fā)明還提供了一種具有群體淬滅活性的枯草芽孢桿菌基因工程菌在制備防治胡蘿卜軟腐歐文氏菌所導(dǎo)致的植物軟腐病藥物中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種具有群體淬滅活性的枯草芽孢桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶編碼基因(ahlX基因)克隆到枯草芽孢桿菌表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，得到具有群體淬滅活性的枯草芽孢桿菌基因工程菌。

作為優(yōu)選，所述表達(dá)載體以pHT01基礎(chǔ)，去除其表達(dá)調(diào)控蛋白的編碼基因lacI，使其能夠在不添加誘導(dǎo)劑的條件下，在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)。

作為優(yōu)選，所述酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶能夠有效水解酰基高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子。

作為優(yōu)選，所述表達(dá)載體的構(gòu)建包括下步驟：