[發明專利]鄰苯二酚1,2-雙加氧酶突變體及其應用有效
| 申請號： | 202110522691.1 | 申請日： | 2021-05-13 |
| 公開（公告）號： | CN113151204B | 公開（公告）日： | 2022-04-15 |
| 發明（設計）人： | 應漢杰;冷靜;牛歡青;林康;胡瑞佳;朱晨杰;陳勇;柳東 | 申請（專利權）人： | 南京工業大學 |
| 主分類號： | C12N9/02 | 分類號： | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/44;C12R1/19 |
| 代理公司： | 江蘇圣典律師事務所 32237 | 代理人： | 肖明芳 |
| 地址： | 211800 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 鄰苯二酚 雙加氧酶 突變體 及其 應用 | ||
1.一種鄰苯二酚1，2-雙加氧酶突變體，其特征在于，所述鄰苯二酚1，2-雙加氧酶突變體是以序列SEQ ID NO.1所示的野生型鄰苯二酚1，2-雙加氧酶序列為基礎，將其第90位纈氨酸殘基替換為丙氨酸或將第206位異亮氨酸殘基替換為纈氨酸后得到。
2.權利要求1所述的鄰苯二酚1，2-雙加氧酶突變體的編碼基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示，其編碼的氨基酸列的序列如SEQ ID NO.5 所示。
3.一種重組載體，其特征在于，包含權利要求2所述的編碼基因。
4.一種重組菌，其特征在于，通過將權利要求3所述的重組載體轉化至宿主微生物中得到。
5.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌的宿主菌為
6.權利要求4所述的重組菌在制備鄰苯二酚1,2-雙加氧酶突變體中的應用。
7.權利要求4所述的重組菌在合成4位取代順,順-粘康酸中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，包括如下步驟：
（1）將重組菌種子液接種到培養基中，培養至OD600nm為0.6-0.8時，加入IPTG，誘導表達后，離心收集菌泥；
（2）酶催化：將步驟（1）得到的菌泥進行超聲破碎，離心，得到含鄰苯二酚1,2-雙加氧酶突變體的粗酶液；向Tris-HCl緩沖液中添加粗酶液和4位取代兒茶酚，建立酶催化反應體系，進行酶催化反應，生成相應4位取代順，順-粘康酸。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，步驟（2）中，所述的Tris-HCl緩沖液中Tris-HCl的終濃度為50-100 mM；4位取代兒茶酚的終濃度為10-90 mM；粗酶液的終用量為0.1-1 U/mL。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，步驟（2）中，所述的酶催化反應為在pH6.0-10.0，20-45 ℃反應1-9 h。
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