[發明專利]靶向治療Rspo過度激活導致的結直腸癌的融合蛋白SZ1及其偶聯納米藥物

有效

• 申請號: 202110515346.5
• 申請日: 2021-05-12
• 公開（公告）號: CN113307882B
• 公開（公告）日: 2022-12-20
• 發明（設計）人: 盛韌;鄭少欽;劉思宇;張曦
• 申請（專利權）人: 東北大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/14;C12N9/00;C12N15/62;C12N15/867;A61K38/53;A61K38/17;A61K33/242;A61K47/52;A61K47/64;A61K47/69;A61P35/00
• 代理公司: 沈陽東大知識產權代理有限公司 21109
• 代理人: 李珉

1.一種靶向治療Rspo過度激活導致的結直腸癌的融合蛋白SZ1，其特征在于，所述的融合蛋白SZ1是由人類FZD5分泌信號肽、V5標簽肽、人類LGR4部分胞外域、連接區域、人類ZNRF3部分胞外域以及小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域所依次排列組成；

其中，通過檢索NCBI GenBank查找cDNA序列，利用基因合成的方式獲得用于擴增人類FZD5分泌信號肽、V5標簽肽、人類LGR4部分胞外域、連接區域、人類ZNRF3部分胞外域以及小鼠IgG2α/人IgGH3 Fc域的cDNA序列所需的PCR引物；

用于擴增人類FZD5分泌信號肽及V5標簽肽對應的cDNA序列所需的PCR引物為：FWD：CCGGAATTCGCCACCATGGCTCGGCCT；REV：CCGCTCGAGCGTAGAATCGAGACCGAGGA；

用于擴增人類LGR4部分胞外域對應的cDNA序列所需的PCR引物為：FWD：GCGTCGACGCGCCACCTCTCTGCGCTG；REV：ACCTGTTGAAGGTGTACAATGGATGATTA；

用于擴增連接區域及人類ZNRF3部分胞外域對應的cDNA序列所需的PCR引物為：FWD：TAATCATCCATTGTACACCTTCAACAGGTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTAAGGAGACGGCGTTCGTGGAGGT；REV：CATGTCAAAGTATTCAGTGGGTTGTCG；

用于擴增小鼠IgG2αFc域對應的cDNA序列所需的PCR引物為：FWD：CGACAACCCACTGAATACTTTGACATGGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTCCCAGAGGGCCCACAATCAAG；REV：CCACTAGTCTATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG；

用于擴增人IgGH3 Fc域對應的cDNA序列所需的PCR引物為：FWD：CGACAACCCACTGAATACTTTGACATGGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTGGTTCTCCCAGAGGGCCCACAATCAAG；REV：CCACTAGTCTATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG；

通過PCR技術擴增得到以上cDNA序列，利用overlapping PCR技術將通過PCR技術擴增后的cDNA序列按順序整合成一段完整的融合蛋白SZ1所對應的cDNA序列；

將得到的完整的融合蛋白SZ1所對應的cDNA序列插入自構建的慢病毒表達載體EF1α啟動子下游，從而得到包含完整的融合蛋白SZ1所對應的cDNA序列的SZ1質粒；

將得到的包含完整的融合蛋白SZ1所對應的cDNA序列的SZ1質粒使用細胞轉染試劑，或通過慢病毒載體psPAX2包裝、侵染使得所用的哺乳動物細胞系對完整的表達融合蛋白SZ1的質粒進行蛋白表達；在細胞轉染或慢病毒侵染后收集被轉染或侵染的哺乳動物細胞的培養基；收集的培養基內含有由完整的表達融合蛋白SZ1的質粒所表達的分泌蛋白，即為融合蛋白SZ1。