[發明專利]無質粒、無誘導劑使用的產D-泛酸基因工程菌及構建方法

有效

• 申請號: 202110512009.0
• 申請日: 2021-05-11
• 公開（公告）號: CN113278569B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 柳志強;張博;陳力;金潔漪;李波;王培;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/31;C12N15/113;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明涉及一種高產D?泛酸的基因工程菌、構建方法，及其在微生物發酵制備D?泛酸中的應用。本發明通過對大腸桿菌的有機酸合成途徑相關基因進行了阻斷，減少有機酸的副作用及增加丙酮酸池的積累，加強丙酮酸合成途徑基因pykA，加強丙酮酸積累，解除關鍵酶的負反饋抑制，解決D?泛酸合成的瓶頸步驟，改善糖攝取能力，增加了前體丙酮酸的積累，過表達基因lpd、ilvD改善主路合成途徑基因的表達情況，最終獲得更高產D?泛酸工程菌，無需質粒引入外源酶增強關鍵酶酶活，搖瓶發酵產量達到3.99g/L；敲除阻遏蛋白編碼基因lacI后形成組成型表達，并進行培養基優化后，搖瓶發酵產量達到4.72g/L；在5L發酵罐中分批補料發酵，產量達到34.28g/L。

(一)技術領域

本發明屬于代謝工程領域，具體涉及無質粒、無誘導劑使用的高產D-泛酸基因工程菌及其構建方法和應用。

(二)背景技術

泛酸屬于維生素B族，又稱維生素B5，是一種水溶性維生素，存在D型和L型兩種構型，但僅D-型(D-PA)具有生物活性。泛酸在生物體內可作為輔酶A(CoA)的前體，在幾乎所有的生物過程中發揮關鍵作用，推動生物體內的能源代謝和能量交換。泛酸的磷酸化產物巰基乙胺可以合成4-磷酸泛酰巰基乙胺，為輔酶A(CoA)及酰基載體蛋白(ACP)的組成部分，而CoA及ACP構成酰基轉移酶的輔酶，廣泛參與糖、脂類、蛋白質代謝及肝臟的生物轉化作用，對生物體的生長起到顯著的促進作用，但目前發現泛酸只能由植物和微生物合成。動物不能合成泛酸，需要從外界攝取，因此泛酸廣泛地應用于食品工業、化妝品以及食品添加劑和飼料添加劑，具有良好的市場價值。

目前，D-泛酸的生產方法包括物理誘導結晶法、拆分法以及微生物法，其中微生物法又包含代謝工程法、發酵法和生物酶法。鑒于綠色發展的興起與需要，物理誘導結晶法、拆分法存在毒性和環境污染、拆分試劑貴的問題，亟需對此方法做出轉變，隨著生物技術的不斷深入研究，許多化學產品可以通過生物法生產。對于D-泛酸的生物生產，現在生物酶法雖然取得較大進步，但依然需要昂貴的前體，是不經濟的，而發酵法缺乏合適的菌株，故通過代謝工程的方法構建一株高產D-泛酸的生產菌株。

工業上常用的生產宿主菌株包括大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌，但是谷氨酸棒桿菌因工程改造較為復雜、周期較長，菌株改進難度大。目前利用谷氨酸棒桿菌生產D-泛酸產量尚不足 2g/L，不利于工業化生產D-泛酸。大腸桿菌是另一種常用的氨基酸生產菌，大腸桿菌具有遺傳背景清晰，操作簡便等優點。

在大腸桿菌中，泛酸是由β-丙氨酸及泛解酸合成的，分別由β-丙氨酸代謝、泛解酸代謝以及泛酸合成三部分組成。β-丙氨酸是由天門冬氨酸-α-脫羧酶(L-aspartate-alpha-decarboxylase) 立體特異性地脫去L-Asp的α位羧基而成，同時釋放CO2；泛解酸代謝途徑中，來源于直接前體-丙酮酸，首先在乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸異構還原酶、2-羥基脫水酶作用形成α-酮異戊酸，然后α-酮異戊酸在羥甲基轉移酶(ketopantoatehydroxymethyltransferase，KPHMT)作用下生成酮泛解酸，后者在酮泛解酸還原酶作用下還原生成泛解酸。最后β-丙氨酸和泛解酸在泛酸合成酶(pantothenate synthetase，PS)的作用下合成泛酸。