[發明專利]牛胚胎分割的方法

有效

• 申請號: 202110511512.4
• 申請日: 2021-05-11
• 公開（公告）號: CN112914784B
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 韓勇權;王小武;王娜;陳建美;郭春明;許曉椿
• 申請（專利權）人: 天津力牧生物科技有限公司
• 主分類號: A61D19/00
• 分類號: A61D19/00;C12N5/073;C12N5/075
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及牛胚胎分割的方法，包括如下步驟：采集卵母細胞并使其進行體外成熟；使精子懸液與成熟的卵母細胞在受精培養液滴孵育以完成體外受精；體外受精操作完畢后使胚胎在胚胎培養液中培養至桑椹胚生長良好，顯微鏡下挑選出桑椹胚；制作分割液滴；將桑椹胚移入分割液滴內，置于倒置顯微鏡下，用固定管固定住胚胎，用分割刀逐漸由上向下壓胚胎將胚胎一分為二；將分割所得半胚移入胚胎培養液中培養，至桑椹胚發育成可用于胚胎移植的擴張囊胚，所述分割液包含磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、蔗糖、聚維酮等。本發明方法和所用的分割液呈現如說明書所述優異技術效果。

技術領域

本發明屬于動物繁殖技術領域，涉及一種用于農業-畜牧獸醫繁殖的技術，具體涉及一種牛體外胚胎分割的方法，另外，本發明還涉及牛胚胎分割所用試液在牛胚胎分割中的應用。本發明牛胚胎分割的方法具有優異的技術效果。尤其是，本發明涉及一種對離體采集獲得的牛卵母細胞在體外受精后獲得的胚胎進行分割的技術。

背景技術

隨著現代農業科技的發展，為了更充分利用良種母牛的繁殖潛力，加速遺傳育種進程，在生產實踐中應用高效的繁殖新技術成為必然。

活體采卵(Ovum?pick?UP，OPU)和體外受精技術(In?Vitro?Fertilization，IVF)是二十世紀八十年代快速發展起來的胚胎工程新技術，二者相結合可獲得大量遺傳系譜明確的胚胎，從而縮短世代間隔。目前，這兩種技術已經成為歐美和大洋洲等畜牧業發達國家的農場主為擴大良種母牛群而采用的重要繁殖技術。另外，基于活體采卵和體外受精技術延伸出來的胚胎分割技術，亦是加速遺傳育種進程的有力工具。

胚胎分割技術在劉永華文獻(劉永華，等，哺乳動物胚胎分割技術研究進展，中國畜牧獸醫，2007，34(3):52)中有詳細闡述，其全部內容通過引用并入本文。具體地說，胚胎分割是指將哺乳動物的胚胎采用手術或非手術的方法從子宮或輸卵管中取出，人為的利用機械或化學方法，將胚胎分割成2個或多個部分，分割后的每個部分在適宜的條件下進行體外培養、移植回受體子宮或輸卵管(或不經過培養直接移植)，可從1枚胚胎獲得2個或多個基因型和表型一致的后代。胚胎分割技術可用于擴增可用的優良胚胎的數目和生產同卵雙胎、同卵多胎的克隆動物，可用于瀕危動物的保護，也可為早期胚胎遺傳疾病的檢查和性別鑒定等技術提供一種活體組織檢查的方法。哺乳動物胚胎分割技術始于Nicholas(1942)對大鼠2-細胞胚胎卵裂球的分離和培養研究。Tarkowski(1959)發現一半卵裂球已經被破壞的2-細胞小鼠胚胎可以發育成囊胚，并生出了小鼠，其后，他研究了小鼠1/4、2/4、3/4卵裂球的發育規律，其結果表明：早期胚胎的每個卵裂球都具有發育全能性，即能發育成正常個體，并通過胚胎分割得到了世界上首例半胚來源的活體動物。Mullen等(1970)將小鼠2-細胞胚胎的2個卵裂球分離，經培養后再移植給受體，產生了哺乳動物的第一例人工雙胞胎。此后，動物胚胎分割技術迅速發展起來，并在20世紀80年代中后期達到了一個高潮。Willadsen(1979)最初用顯微手術方法，分別將綿羊2-細胞胚和桑椹胚一分為二或一分為四，再將所分得的卵裂球用瓊脂包埋，在綿羊輸卵管內培養3～5d，取出后將胚胎剝離移植給受體，獲得同卵雙胞胎和同卵四胞胎。但是此法中間環節多，操作煩瑣，難以在生產上應用推廣。1981年，他去除了綿羊4細胞期胚胎的透明帶，使4個分裂球分離，移植給受體后得到同卵四羔與同卵三羔。同年，Willadsen又與Ploge合作，將8-細胞期的牛胚胎分割為4個1/4胚，并獲一同卵三胎，一對同卵雙胎和一單胎。Willadsen(1980)首先將胚胎分割技術與胚胎超低溫冷凍技術結合起來，利用綿羊冷凍保存半胚獲得3只活羔羊。1984年他改進了方法，分割較晚期的胚胎(桑椹胚或囊胚)，分割后的胚胎可以不經過培養直接移植，因而具有很大的實用價值。Gyu-Jin(1998)又利用卵母細胞體外成熟、體外受精的方法獲得了牛胚胎，移植12枚四分胚到6頭受體，得到2頭四分胚的犢牛。這為胚胎分割技術又開辟了新的研究和應用領域。