[發明專利]一種檢測血清中游離雌三醇含量的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202110508473.2
• 申請日: 2021-05-11
• 公開（公告）號: CN113189242A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 彭軍;劉超
• 申請（專利權）人: 安徽歆智生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 安徽知問律師事務所 34134
• 代理人: 代群群

1.一種檢測血清中游離雌三醇含量的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1：制備檢測樣品上清液、替代分析物標準曲線樣品上清液和質控樣品上清液；

步驟2：對檢測樣品上清液、替代分析物標準曲線樣品上清液和替代分析物質控樣品上清液進行超高效液相色譜串聯質譜分析，得相應色譜峰面積；

步驟3：數據分析：

分析色譜峰面積，替代校正曲線以1/x²為加權系，用所述替代分析物標準曲線樣品上清液中替代分析物及其內標的色譜峰面積的比值對替代分析物標準曲線樣品中替代分析物的濃度進行線性回歸得到檢測樣品上清液中游離雌三醇含量計算公式y＝ax+b，其中，

x為檢測樣品上清液中雌三醇濃度，y為檢測樣品上清液中分析物的色譜峰面積和內標的色譜峰面積的比值，a為校正曲線的斜率，b為校正曲線y軸的截距；

所述替代分析物為雌三醇的同位素化合物。

2.根據權利要求1所述的一種檢測血清中游離雌三醇含量的方法，其特征在于：所述同位素化合物為雌三醇-2,3,4-¹³C₃。

3.根據權利要求1所述的一種檢測血清中游離雌三醇含量的方法，其特征在于：所述步驟1中包括使用萃取劑萃取的步驟，所述萃取劑為甲基叔丁基謎和乙酸乙酯的混合溶液，所述甲基叔丁基謎和乙酸乙酯的體積比為1:2。

4.根據權利要求3所述的一種檢測血清中游離雌三醇含量的方法，其特征在于：

所述萃取的具體步驟為：分別取檢測樣品、替代分析物標準曲線樣品和替代分析物質控樣品加入緩沖液和內標混合，加入萃取劑；使用復溶劑復溶，所述復溶劑為體積分數50％的甲醇溶液，所述復溶劑和萃取液的體積比為1:9。

5.根據權利要求4所述的一種檢測血清中游離雌三醇含量的方法，其特征在于：所述緩沖液為pH值9.2的乙酸銨緩沖液；所述內標為200ng/mL的雌三醇-d₆溶液。

6.根據權利要求4所述的一種檢測血清中游離雌三醇含量的方法，其特征在于：所述方法還包括替代分析物標準曲線的繪制，以替代分析物濃度為橫坐標，以替代分析物與相應內標物峰面積比值為縱坐標，繪制替代分析物標準曲線。

7.根據權利要求6所述的一種檢測血清中游離雌三醇含量的方法，其特征在于：

所述替代分析物標準曲線包括0.02、0.2、1、5、10、50、90和100ng/mL八個濃度梯度；所述替代分析物質控樣品包括0.06、2和80ng/mL三個濃度梯度。

8.根據權利要求1所述的一種檢測血清中游離雌三醇含量的方法，其特征在于：所述超高效液相色譜的條件為：

進樣器溫度：15℃；柱溫：40℃；運行時間：2min；洗脫梯度：

所述流動相A：含體積分數0.05％氨水和0.1mM氟化銨的水溶液；

所述流動相B：甲醇和乙腈體積比為1:1的溶液。

9.根據權利要求1所述的一種檢測血清中游離雌三醇含量的方法，其特征在于：所述質譜的條件中多反應監測參數為：

掃描模式：多反應離子檢測負離子模式；離子源：渦輪噴霧；電離模式：電噴霧離子化；霧化氣：60psi；輔助加熱器：60psi；氣簾氣：40psi；碰撞氣：10；噴霧電壓：-5000V；離子源溫度：500℃。

10.一種實現權利要求1-9任一項所述檢測血清中游離雌三醇含量方法的試劑盒，其特征在于：包括以下試劑：

替代分析物，所述替代分析物為雌三醇的同位素化合物；

內標；

萃取劑；

緩沖液。