[發明專利]一種CRISPR/Cas9特異性敲除大豆SOC1基因的方法及其應用

有效

• 申請號: 202110508397.5
• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113265418B
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發明（設計）人: 孔凡江;楊慧;寇坤
• 申請（專利權）人: 廣州大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/55;C12N15/29;A01H5/02;A01H5/04;A01H5/00;A01H6/54;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

1.CRISPR/Cas9特異性敲除大豆SOC1基因的方法在創制高產大豆種質資源中的應用，其特征在于，CRISPR/Cas9特異性敲除大豆SOC1基因的方法包括如下步驟：

利用CRISPR/Cas9系統對大豆中同源基因SOC1a和SOC1b進行基因編輯，獲得同時靶向編輯SOC1a和SOC1b編碼區的CRISPR/Cas9敲除載體；

所述CRISPR/Cas9系統對大豆中同源基因SOC1a和SOC1b進行靶向編輯時涉及如下四個編輯靶點：

靶點1：位于SOC1b基因第二外顯子上；所述靶點1的接頭引物序列如SEQ ID. NO.1和SEQ ID. NO.2所示；

靶點2：位于SOC1a基因第二外顯子上；所述靶點2的接頭引物序列如SEQ ID. NO.3和SEQ ID. NO.4所示；

靶點3：位于SOC1b基因第一外顯子上；所述靶點3的接頭引物序列如SEQ ID. NO.5和SEQ ID. NO.6所示；

靶點4：位于SOC1a基因、SOC1b基因第三外顯子上；所述靶點4的接頭引物序列如SEQID. NO.7和SEQ ID. NO.8所示；

通過將所述靶點1、靶點2、靶點3、靶點4的接頭引物分別組裝到相對應的四個sgRNA載體上，所述四個sgRNA載體分別由擬南芥U3d、U3b、U6-1和U6-29啟動子串聯啟動后與pYLCRISPR/Cas9-DB載體連接，創制獲得pYLCRISPR/Cas9-SOC1s-sgRNA敲除載體。

2.一種培育高產大豆品種的方法，其特征在于，將權利要求1所述pYLCRISPR/Cas9-SOC1s-sgRNA敲除載體轉化農桿菌，并侵染大豆子葉節進行穩定遺傳轉化，獲得純合soc1a1b雙突變體大豆植株。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述純合soc1a1b雙突變體大豆植株中SOC1a突變基因和SOC1b突變基因的編碼區相對于原始基因均有1bp缺失，導致SOC1a突變基因和SOC1b突變基因編碼蛋白質的翻譯被提前終止。

4.用于鑒定含有權利要求3所述SOC1a突變基因和SOC1b突變基因材料的分子標記物，其特征在于，所述分子標記物為分別基于SOC1a突變基因和SOC1b突變基因構建的兩個dCAPs標記，用于鑒定SOC1b突變基因的dCAPs標記的引物如SEQ ID. NO.35～SEQ ID.NO.37所示；用于鑒定SOC1a突變基因的dCAPs標記的引物如SEQ ID. NO.38～SEQ ID.NO.41所示。