[發明專利]一種能夠快速檢測TMAO生物標志物的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202110508077.X
• 申請日: 2021-05-11
• 公開（公告）號: CN113376267A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 趙良才;董俊一
• 申請（專利權）人: 蘭立生物科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 蘇州市方略專利代理事務所(普通合伙) 32267
• 代理人: 石磊

1.一種能夠快速檢測TMAO生物標志物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（S1）建立標準曲線：取空白血漿樣品，加入甲醇后進行渦旋振蕩，然后裝入離心機進行離心處理，取上清液加水稀釋；然后加入TMAO和內標，配制成一系列含內標濃度相同含TMAO濃度不同的標準樣品；通過液相色譜-質譜聯用對一系列標準樣品進行測試，計算得到各標準樣品對應的TMAO峰面積與內標峰面積的比值（Y）和各標準樣品對應的TMAO濃度與內標濃度的比值（X），作出Y隨X的變化曲線，即為標準曲線；

（S2）預處理樣品檢測：通過液相色譜-質譜聯用對預處理血漿樣品進行檢測，計算得到TMAO峰面積與內標峰面積的比值，代入標準曲線，得到預處理樣品中TMAO濃度與內標濃度的比值；根據預處理過程中的稀釋倍數計算得到原始血漿樣品中TMAO的濃度；

血漿樣品預處理方法為：取血漿樣品，加入含有內標的甲醇溶液后進行渦旋振蕩，然后裝入離心機進行離心處理，取一定量上清液加水稀釋得預處理血漿樣品。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，血漿樣品預處理方法為：取血漿樣品加入含有內標的甲醇溶液進行蛋白沉淀，離心處理使樣品分層，再加水稀釋。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，血漿樣品預處理方法為：取血漿樣品35μL，加入100μL含有內標的甲醇溶液后進行渦旋振蕩30-45s，然后裝入離心機進行離心處理，離心機分離因數RCF為3600-8000，取50μL上清液加入200μL去離子水稀釋得預處理血漿樣品。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，血漿樣品預處理過程中，內標的甲醇溶液為d9-TMAO濃度 30ng/mL的甲醇溶液。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（S1）中，取空白血漿樣品350μL，加入1000μL甲醇后進行渦旋振蕩30-45s，然后裝入離心機進行離心處理，離心機分離因數RCF為3600-8000；取500μL上清液加入2000μL去離子水稀釋，然后加入TMAO，用水逐步稀釋得到10個含不同濃度的TMAO的溶液，TMAO濃度分別為：10、25、55、80、100、200、400、500、800、1000ng/mL；每個溶液各取300μL，各加入100μL含30ng/mL的d9-TMAO的甲醇溶液，得到一系列標準樣品。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，液相色譜條件如下：

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18液相色譜柱；

流動相：體積比為88:12的乙腈與0.1%甲酸水溶液；

流速：0.3-0.5mL?min^-1；

柱溫：35-40℃；

進樣量：5μL；

洗脫方式：等度洗脫。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，質譜條件如下：

質譜儀：三重四極桿質譜儀；

掃面模式：電噴霧正離子模式；

采集模式：質譜多反應監測（MRM）；

離子源電壓：4000 V；

離子源溫度：400 ℃；

氣簾氣：25 psi；

霧化氣（gas 1）：50 psi；

輔助氣（gas 2）：40 psi。

8.一種試劑盒，其特征在于，包括以下試劑：

試劑A：d9-TMAO濃度為 30ng/mL的甲醇溶液；

系列試劑B：如權利要求5所使用的標準樣品。

9.根據權利要求8所述的試劑盒的用途，其特征在于，所述試劑盒在液質聯用檢測血液中TMAO含量時使用，試劑A用作內標物，系列試劑B用作標準樣品以獲得確定色譜條件下的標準曲線。