[發明專利]土壤中大麗輪枝菌微菌核的檢測方法及培養基及制備方法

在審

• 申請號: 202110507441.0
• 申請日: 2021-05-10
• 公開（公告）號: CN113201573A
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 張鍵;楊劍鋒;趙君;賈碩;張文兵;馮伊彤;賈瑞芳;曼德拉;張之為;鄭國華
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12Q1/04;C12M1/26;C12M1/34;C12M1/00;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 深圳市威世博知識產權代理事務所(普通合伙) 44280
• 代理人: 劉彩霞

本發明公開了土壤中大麗輪枝菌微菌核的檢測方法及培養基及制備方法，其中，檢測方法包括：(1)取土樣并進行無菌處理；(2)配制大麗輪枝菌微菌核培養基；(3)利用采樣器?干篩法分離微菌核裝置采集土樣；(4)采集的土樣進行大麗輪枝菌微菌核培養；(5)對培養后土樣中大麗輪枝菌微菌核進行計數。大麗輪枝菌微菌核培養基包括PartⅠ培養基、PartⅡ培養基和PartⅢ培養基；配制PartⅠ培養基、PartⅡ培養基和PartⅢ培養基，然后將PartⅠ培養基和PartⅡ培養基滅菌后加入PartⅢ培養基中混合均勻制備得到大麗輪枝菌微菌核培養基；本發明檢測方法可快速準確檢測不同地塊大麗輪枝菌微菌核的含量。

技術領域：

本發明涉及微生物檢測技術領域，特別是涉及土壤中大麗輪枝菌微菌核的檢測方法及培養基及制備方法。

背景技術：

向日葵黃萎病的病原菌是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)引起的，屬于半知菌亞門真菌。大麗輪枝菌寄主范圍廣泛，可危害200多種植物，包括多種農作物、景觀植物、果樹和一年或多年生牧草，并且其寄主范圍仍在擴大。該菌菌絲體呈明顯輪枝狀，有分隔，老熟時加粗變褐，后期產生黑色微菌核。微菌核是病原菌在土壤中主要的休眠結構，抵抗不良環境能力強，是土壤中病原菌長期存活及初侵染的主要形式。因為其為病害的初侵染源，微菌核的數量及存活狀態決定著黃萎病的發生嚴重程度。

目前，土壤中黃萎病菌微菌核定量檢測方法多而復雜，最為常規的檢測方法為土壤稀釋梯度分離法，該方法操作復雜、實驗周期長并且易受主觀判斷影響。利用分子檢測對精細度要求較高且代表性不強。用濕篩法和果膠鹽選擇性培養基可定量分析土壤中大麗輪枝菌的定殖情況，但對微菌核含量較少的土壤檢測能力弱。而后大量研究人員通過選擇用選擇性培養基分離培養微菌核，雖然可定量分析土壤中大麗輪枝菌的定殖情況，但對微菌核含量較少的土壤檢測能力弱，對鐮刀菌等雜菌抑制效果差，且培養基成分復雜且難以進行觀察和統計。

發明內容：

本發明的第一個目的在于提供一種快速、準確、操作簡單的土壤中大麗輪枝菌微菌核的檢測方法。

本發明的第二個目的在于提供一種對大麗輪枝菌微菌核具有良好選擇性的大麗輪枝菌微菌核培養基。

本發明的第三個目的在于提供一種對大麗輪枝菌微菌核具有良好選擇性的大麗輪枝菌微菌核培養基的制備方法。

本發明的第一個目的由如下技術方案實施：土壤中大麗輪枝菌微菌核的檢測方法，其包括如下步驟：

(1)取土樣并進行無菌處理；

(2)配制大麗輪枝菌微菌核培養基：按照大麗輪枝菌微菌核培養基中各組分比例分別配制PartⅠ培養基、PartⅡ培養基和PartⅢ培養基，然后將配制好的PartⅠ培養基和PartⅡ培養基分別經121℃滅菌15～20min，并降溫至50～56℃后加入PartⅢ培養基中混合均勻制備得到大麗輪枝菌微菌核培養基；本發明培養基相對于現有同類型培養基的具有明顯的雜菌抑制效果，且成分較為簡單，操作簡便，易于觀察。

(3)利用采樣器-干篩法分離微菌核裝置采集土樣：培養皿中放入配制好的大麗輪枝菌微菌核培養基，然后將培養皿放入采樣器-干篩法分離微菌核裝置的微生物采樣器中，啟動采樣器-干篩法分離微菌核裝置，并將采樣器-干篩法分離微菌核裝置的壓強調至-0.08～-0.06MPa，稱量土樣，并將稱取的土樣快速倒入微生物采樣器頂端入口中，封住微生物采樣器頂端入口5-10s，土樣會均勻平鋪在培養皿中；采樣器-干篩法分離微菌核裝置停止運行，取出培養皿；在本發明設定的壓力范圍內，能夠保證土樣在培養皿中均勻分布。

(4)采集的土樣進行大麗輪枝菌微菌核培養；

(5)對培養后土樣中大麗輪枝菌微菌核進行計數。

進一步，所述PartⅠ培養基為每500mL蒸餾水中添加5g Polygalacturonic Acid(聚半乳糖醛酸)(P-3889，SIGMA公司)和1.4g NaOH；