[發(fā)明專(zhuān)利]一種精漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的定量測(cè)定方法及試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110503194.7
• 申請(qǐng)日: 2021-05-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114034648A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張道兵
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 珠海高瑞特醫(yī)療科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N21/31
• 分類(lèi)號(hào): G01N21/31
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽(yáng)光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11003
• 代理人: 陳志

本發(fā)明公開(kāi)了一種精漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的定量測(cè)定方法及試劑盒，包括：取精液標(biāo)本，離心，取上清液于離心管中，得到精漿標(biāo)本，向精漿標(biāo)本中加入試劑1以及試劑2，混勻，測(cè)定吸光度值A(chǔ)_測(cè)定1，其中，試劑1為包括還原型谷胱甘肽、EDTA?Na₂以及疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液，試劑2為包括谷胱甘肽還原酶以及NADPH的磷酸鹽緩沖液；向所述精漿標(biāo)本中加入試劑3，混勻，反應(yīng)，測(cè)定吸光度值A(chǔ)_測(cè)定2，其中試劑3為包括異丙苯過(guò)氧化氫的磷酸鹽緩沖液；同樣步驟得到空白對(duì)照組，測(cè)定吸光度值A(chǔ)_空白1，再加入試劑3，混勻，反應(yīng)，測(cè)定吸光度值A(chǔ)_空白2；將測(cè)定值通過(guò)以下公式進(jìn)行計(jì)算：GSH?Px活性(nmol/min/mL)＝[(△A測(cè)定?△A空白)÷ε÷d×V_總×10⁶]÷V_樣÷T。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于精子生化指標(biāo)體外檢測(cè)的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種精漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的定量測(cè)定方法及試劑盒。

背景技術(shù)

大量已發(fā)表的證據(jù)表明氧化應(yīng)激在精子功能損害中起作用，活性氧增多常導(dǎo)致精子活力降低、精子DNA完整性受損、頂體反應(yīng)及精子與卵子融合能力減低。精漿和精子中存在的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)是一種抗氧化物質(zhì)，能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與活性氧反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽，從而保護(hù)精子免受活性氧損害，維持其正常功能。精子中的GSH-Px主要位于細(xì)胞質(zhì)中，但由于精子含有的細(xì)胞質(zhì)較少，機(jī)體主要依靠精漿中GSH-Px發(fā)揮抗氧化作用。精漿中GSH-Px活性降低表明精子抗氧化能力減弱，可導(dǎo)致精子質(zhì)膜的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷發(fā)生，是引起男性不育的重要病理因素之一。

目前，實(shí)驗(yàn)室GSH-Px活性主要采用兩種方法，一是采用苯甲酸底物法進(jìn)行GSH-Px活性檢測(cè)，該方法利用GSH-Px可催化谷胱甘肽(GSH)與苯甲酸發(fā)生氧化反應(yīng)，生成黃色陰離子，該物質(zhì)在422nm處有吸收峰，吸光度值與GSH減少的量成正比，從而間接推算GSH-Px活性。該方法操作簡(jiǎn)單，但檢測(cè)結(jié)果精密度差。二是采用紫外分光光度法檢測(cè)GSH-Px活性，該方法利用過(guò)氧化氫(H₂O₂)或叔丁基化過(guò)氧氫在GSH-Px催化下與GSH反應(yīng)生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSSG在谷胱甘肽還原酶(GRD)催化下被NADPH還原為GSH，同時(shí)NADPH被氧化生成NADP+，NADPH在340nm有吸收峰，吸光度變化值與GSH-Px活性成反比。因此，通過(guò)測(cè)定340nm吸光度減少速率可計(jì)算出GSH-Px活性。但H₂O₂或叔丁基化過(guò)氧氫在水溶液中易揮發(fā)，穩(wěn)定性差，且叔丁基化過(guò)氧氫為易燃、易爆品，安全隱患大。另外，該方法檢測(cè)結(jié)果雖然比終點(diǎn)法準(zhǔn)確度有所提高，但一些生殖道感染患者精液標(biāo)本中內(nèi)源性過(guò)氧化物酶可與H₂O₂或叔丁基化過(guò)氧氫反應(yīng)，使檢測(cè)結(jié)果假性減低，不能滿(mǎn)足臨床診療需求。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種精漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的定量測(cè)定方法，通過(guò)采用異丙苯過(guò)氧化氫作為氧化劑，疊氮鈉抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，使得本方法準(zhǔn)確度高、精密度好、安全性高、操作簡(jiǎn)單、可自動(dòng)化、易于臨床推廣。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種精漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的定量測(cè)定方法，包括步驟如下：

步驟一：取精液標(biāo)本，離心，取上清液于離心管中，得到精漿標(biāo)本，向所述精漿標(biāo)本中加入試劑1及試劑2，混勻，測(cè)定吸光度值A(chǔ)_測(cè)定1，其中，所述試劑1為包括還原型谷胱甘肽、EDTA-Na₂以及疊氮鈉的磷酸鹽緩沖液，所述試劑2為包括谷胱甘肽還原酶以及NADPH的磷酸鹽緩沖液；

步驟二：向上述混合反應(yīng)液中加入試劑3，混勻，反應(yīng)，測(cè)定吸光度值A(chǔ)_測(cè)定2，其中所述試劑3為包括異丙苯過(guò)氧化氫的磷酸鹽緩沖液；