[發明專利]一種用于鑒定特異性蛋白質乙酰化修飾樣品的制備方法

有效

• 申請號: 202110499285.8
• 申請日: 2021-05-08
• 公開（公告）號: CN113155577B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 王居平;彭慧;農安娜;黃月艷;高潔
• 申請（專利權）人: 右江民族醫學院
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N27/62;G01N33/68
• 代理公司: 廣西中知華譽知識產權代理有限公司 45140
• 代理人: 莫依燦

1.一種用于鑒定特異性蛋白質乙酰化修飾樣品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)通過內源性實驗選擇具有乙酰化修飾的蛋白質A，并通過外源性實驗確定蛋白質A的乙酰化轉移酶B；

2)制備共轉染質粒A和質粒B的蛋白樣品以及單獨轉染質粒A的蛋白樣品：

(1)在至少20個細胞培養皿中分別接種293T細胞，當細胞密度達到78-82％后，用轉染試劑將質粒A單獨轉染一個細胞培養皿的細胞，同時，用轉染試劑將質粒A與質粒B共轉染其余的細胞培養皿的細胞；

(2)將轉染后的細胞培養皿放入培養箱中，于恒溫和恒定二氧化碳濃度下培養6h后，去除含轉染試劑-DNA復合物的培養液，更換新的培養液繼續培養48h；

(3)將培養好的細胞收集于第一離心管中，將細胞沉淀離心后，往所述第一離心管中加入RIPA裂解液；

(4)將上述第一離心管置于垂直旋轉搖床上裂解1h后離心，并將離心所得細胞上清液轉入第二離心管，向所述第二離心管中加入抗體后在垂直旋轉搖床上孵育過夜；

(5)第二天往所述第二離心管中加入瓊脂糖珠后，繼續在垂直旋轉搖床上孵育過夜；

(6)第三天對所述第二離心管內的抗原-抗體-瓊脂糖珠三者復合物離心后，用冷的RIPA裂解液洗3次，最后一次清洗后吸干液體；

(7)往所得的復合物中加入兩倍濃度的上樣緩沖液后，于100℃煮5-8min，再瞬時離心，得到一個單獨轉染質粒A的蛋白樣品和至少19個共轉染質粒A和質粒B的蛋白樣品；

3)從以上共轉染質粒A和質粒B的蛋白樣品中隨機抽取1個蛋白樣品，與單獨轉染質粒A的蛋白樣品一起完成免疫印跡分析；

4)將其余的共轉染質粒A和質粒B的蛋白樣品跑SDS-PAGE膠后，在考馬斯亮藍染液中孵育過夜，第二天在搖床上將膠脫色，直至膠的背景為白色而泳道中蛋白條帶為藍色而終止脫色；根據A的分子量，將目的條帶切下來放入第三離心管中，做好標記，即得所述用于鑒定特異性蛋白質乙酰化修飾樣品。

2.根據權利要求1所述一種用于鑒定特異性蛋白質乙酰化修飾樣品的制備方法，其特征在于：步驟2)的(1)中，所述293T細胞的接種量為5.2X10⁶個/每個細胞培養皿。

3.根據權利要求1所述一種用于鑒定特異性蛋白質乙酰化修飾樣品的制備方法，其特征在于：步驟2)的(1)中，所述轉染試劑為EZ?Trans轉染試劑。

4.根據權利要求1所述一種用于鑒定特異性蛋白質乙酰化修飾樣品的制備方法，其特征在于：步驟2)的(2)中，所述恒溫的溫度為37℃，所述二氧化碳的濃度為5％。

5.根據權利要求1所述一種用于鑒定特異性蛋白質乙酰化修飾樣品的制備方法，其特征在于：步驟2)的(1)中，當細胞密度達到80％后，用轉染試劑將質粒A單獨轉染一個細胞培養皿的細胞，同時，用轉染試劑將質粒A與質粒B共轉染其余的細胞培養皿的細胞。

6.根據權利要求1所述一種用于鑒定特異性蛋白質乙酰化修飾樣品的制備方法，其特征在于：步驟1)中，所述外源性實驗為：在293T細胞中，將質粒A與質粒B共轉染，48h后收細胞，先進行免疫共沉淀，然后做免疫印跡分析。