[發(fā)明專利]外泌體中核酸分子的檢測方法

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• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113151398A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設計）人: 徐學明;馮韻;田金金;馮菲菲
• 申請（專利權）人: 廣州復能基因有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 高麗娜

1.外泌體中核酸分子的檢測方法，其包括以下步驟：

裂解樣品中的外泌體，用于釋放外泌體核酸分子；優(yōu)選地，所述樣品為細胞培養(yǎng)液、血漿、尿液或其它體液樣品；

逆轉錄反應，其中所述外泌體裂解后不經過提取核酸分子或經過提取核酸分子后進行所有RNA的逆轉錄反應，即RT-For-All，使外泌體中所有RNA在同一反應中同時進行逆轉錄；

其中在所述逆轉錄反應中使用包含通用接頭(例如，miRNA Adapter)和隨機引物的逆轉錄緩沖液；

優(yōu)選地，在逆轉錄反應之后進行定量PCR或測序檢測。

2.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其中，所述核酸分子包括RNA(例如mRNA、miRNA、lncRNA、cirRNA)和DNA。

3.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其中，在所述外泌體的裂解步驟中使用外泌體裂解緩沖液進行裂解，其中，所述裂解緩沖液包括pH緩沖鹽(優(yōu)選Tris-Cl)、BSA、RNase抑制劑和非離子去垢劑；

優(yōu)選地，所述非離子去垢劑為TritonX-100、Tween20、NP-40、Igepal的任意一種或多種的組合。

4.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其中所述裂解緩沖液還包括蛋白酶K，用于抑制核酸酶活性并保護核酸不被降解；優(yōu)選地，所述裂解緩沖液還包括DTT。

5.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其中在所述逆轉錄反應步驟中使用逆轉錄反應體系，其包括逆轉錄緩沖液、逆轉錄酶和PolyA聚合酶，優(yōu)選還包括dNTP和ATP。

6.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其中所述逆轉錄反應的條件包括37℃-42℃，5-30min。

7.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其中RT-For-All逆轉錄反應的產物可直接用作多種檢測的底物，例如用于定量PCR(qPCR)進行核酸檢測；也可用作文庫構建用于核酸NGS。

8.用于檢測外泌體中核酸分子的試劑盒，其包括逆轉錄反應體系；其中，所述逆轉錄反應體系包括逆轉錄緩沖液、逆轉錄酶和PolyA聚合酶，優(yōu)選還包括dNTP和ATP；

其中所述逆轉錄緩沖液包括用于逆轉錄小分子RNA的通用接頭(例如，miRNA Adapter)和用于逆轉錄大分子RNA的隨機引物。

9.根據(jù)權利要求8所述的試劑盒，其還包括裂解緩沖液，其中所述裂解緩沖液包括pH緩沖鹽(優(yōu)選Tris-Cl)、BSA、RNase抑制劑和非離子去垢劑；

優(yōu)選地，所述非離子去垢劑為TritonX-100、Tween20、NP-40、Igepal的任意一種或多種的組合。

10.根據(jù)權利要求9所述的試劑盒，其中所述裂解緩沖液還包括蛋白酶K，用于抑制核酸酶活性并保護核酸不被降解；優(yōu)選地，所述裂解緩沖液還包括DTT。