[發(fā)明專利]釀酒酵母工程菌及其在制備原兒茶酸中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110495688.5
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113234611B
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 元英進;李炳志;張仁寬
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/52;C12N15/31;C12N15/81;C12P7/42;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 王歡

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及釀酒酵母工程菌及其在制備原兒茶酸中的應(yīng)用。本發(fā)明在釀酒酵母菌株的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)入外源基因4CL、Ech、Fcs、vdh、PobA中的至少一種。本發(fā)明通過精準(zhǔn)控制以上關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)入，在酵母體內(nèi)構(gòu)建了一種全新的利用木質(zhì)素或?qū)ο愣顾徂D(zhuǎn)化合成原兒茶酸的路徑，實現(xiàn)了利用木質(zhì)素單體及木質(zhì)素合成原兒茶酸。實驗表明，本發(fā)明基因工程菌可以充分利用木質(zhì)素及其衍生的芳香族化合物制備原兒茶酸，不僅可以解決木質(zhì)素的利用問題，而且可以生成原兒茶酸這種重要的化工原料，實現(xiàn)木質(zhì)素的高值化利用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及釀酒酵母工程菌及其在制備原兒茶酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

原兒茶酸作為藥物，在臨床上可用于治療慢性氣管炎、燒傷、小兒肺炎、菌痢、急性盂腎炎、急性胰腺炎及某種潰瘍病的治療。另外，其具有一定的抗氧化抗菌作用，對金黃葡萄球菌，沙門氏菌，大腸桿菌等有抑制作用。原兒茶酸是一種關(guān)鍵的代謝中間體，可以進一步轉(zhuǎn)化為許多化學(xué)物質(zhì)，如己二酸，吡啶2,4-二羧酸等。此外，在最近的研究中，原兒茶酸可以用做合成聚合物的單體。因此原兒茶酸具有廣闊的應(yīng)用前景，化學(xué)合成主要以香蘭素為原料，經(jīng)堿熔溶氧化脫甲基，再經(jīng)酸化制備，該工藝需要240℃以上高溫，反應(yīng)大部分時間為固相反應(yīng)，難于控制，必須使用特殊的反應(yīng)設(shè)備，投資大、設(shè)備利用率低。微生物轉(zhuǎn)化合成原兒茶酸技術(shù)，已經(jīng)進行了開發(fā)研究。原兒茶酸主要通過3-脫氫莽草酸脫水酶(3-dehydroshikimate dehydratase，aroZ)作用于3-脫氫莽草酸(DHS)一步催化形成。利用該基因在大腸桿菌，芽孢桿菌，谷氨酸棒桿菌及釀酒酵母中實現(xiàn)了從葡萄糖合成原兒茶酸，該法環(huán)保、可持續(xù)，并且與化學(xué)法相比，具有經(jīng)濟競爭力，有很好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。除了從糖合成原兒茶酸，利用木質(zhì)素合成原兒茶酸可以減少葡萄糖的使用，促進生物質(zhì)的利用，減少農(nóng)業(yè)廢棄物對環(huán)境的污染。當(dāng)前研究研究利用木質(zhì)素合成原兒茶酸主要是針對木質(zhì)素降解微生物，如紅球菌，惡臭假單胞菌的轉(zhuǎn)化木質(zhì)素合成原兒茶酸及其衍生分子等。然而，木質(zhì)素降解降解菌能夠降解原兒茶酸，導(dǎo)致其原兒茶酸無法積累，需要進行基因的敲除等措施。利用生物安全菌株酵母釀酒酵母轉(zhuǎn)化木質(zhì)素合成原兒茶酸尚未進行研究，本研究針對木質(zhì)素水解液主要單體組成，通過構(gòu)建優(yōu)化木質(zhì)素單體合成原兒茶酸路線，實現(xiàn)了釀酒酵母高效合成原兒茶酸。

生物合成原兒茶酸以葡萄糖研究較多，大腸桿菌引入ubic和pobA基因合成了利用葡萄糖合成了大約110mg/L的原兒茶酸。另外，在谷氨酸棒桿菌中，引入ubic基因，通過在發(fā)酵罐中分批補料發(fā)酵獲得了1140.0±11.6mg/L)原兒茶酸。Michael以蔗糖為原料在釀酒酵母中引入AroZ(DHS dehydratase)和設(shè)計degron-tagged Aro1實現(xiàn)了釀酒酵母CEN.PK利用蔗糖合成了原兒茶酸，通過發(fā)酵過程補充糖經(jīng)過8天發(fā)酵最終獲得了5.6g/L原兒茶酸。除了從糖出發(fā)，以芳香化合物未原料合成原兒茶酸，近期也有研究。戴玉杰等發(fā)明了利用苯酚為原料制備原兒茶酸(3，4-二羥基苯甲酸)的基因工程菌及其構(gòu)建方法。該工程菌含有對羥基苯甲酸脫羧酶基因yclBCD和羥化酶基因pobA，以苯酚為原料，通過生物轉(zhuǎn)化法將苯酚進行加羧獲得對羥基苯甲酸，然后將對羥基苯甲酸3位氧化獲得原兒茶酸(3，4-二羥基苯甲酸)。袁吉鋒等發(fā)明了在大腸桿菌中導(dǎo)入PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA，實現(xiàn)了大腸桿菌從酪氨酸出發(fā)合成原兒茶酸。目前仍未見以木質(zhì)素為原料合成原兒茶酸的報道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了釀酒酵母工程菌及其在制備原兒茶酸中的應(yīng)用。本發(fā)明在釀酒酵母菌株基礎(chǔ)上進行基因改造，在酵母體內(nèi)構(gòu)建了一種新的木質(zhì)素生物轉(zhuǎn)化路徑，獲得的釀酒酵母工程菌可以充分利用木質(zhì)素及其衍生的芳香族化合物合成原兒茶酸，明顯提高了原兒茶酸的含量。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了釀酒酵母工程菌，所述釀酒酵母工程菌釀酒酵母菌株為底盤菌株，轉(zhuǎn)入外源基因4CL、Ech、Fcs、vdh、PobA中的至少一種。