[發明專利]一種iPSC來源肝細胞的仿生微球大規模培養的方法及應用

有效

• 申請號: 202110495150.4
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113151151B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 施曉雷;王經琳;趙遠錦;任昊楨
• 申請（專利權）人: 南京鼓樓醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 蔣廈

本發明涉及一種iPSC來源肝細胞的仿生微球大規模培養的方法，利用微流控技術制備GelMA細胞微載體，在其表面包裹Bcl?2重組蛋白以增強特異性抗凋亡活性，在鏡下觀察其形態，將包裹Bcl?2重組蛋白的GelMA細胞微載體與iPSC來源肝細胞相結合，根據不同直徑細胞微載體的細胞粘附情況篩選最優尺寸，大規模培養后經光鏡、透射電鏡觀察細胞三維結構，檢測細胞微載體上iPSC來源肝細胞活性及功能表達。本發明為一種能夠滿足臨床用細胞數量、細胞活性高、生物相容性好、高效的基于iPSC來源肝細胞的仿生微載體培養方法。

技術領域

本發明涉及生物醫學工程技術領域，具體涉及一種iPSC來源肝細胞的仿生微球大規模培養的方法及應用。

背景技術

終末期肝病導致的肝功能衰竭治療手段有限，單純肝細胞移植或者生物人工肝是比較有前景的治療手段。肝功能衰竭病人的肝支持作用完全依賴于所用肝細胞的特異性生物學功能。目前認為，要達到理想支持效果至少需要10¹⁰以上數量級的細胞，而在保障細胞活性的條件下，肝細胞數量越多，其支持及治療效果將越佳，因此，肝細胞體外大規模培養技術己成為生物人工肝技術發展的核心技術。

人肝細胞是理想的肝細胞源，但是存在著倫理風險；肝臟腫瘤細胞系代謝功能較低，且有致瘤可能；干細胞是理想的新興細胞源，但是分化不穩定；因此選擇合適的、功能強大、低風險的功能肝細胞系也是目前研究的熱點與難點。

雖然肝細胞體外大規模培養技術已取得了許多重大的進展，如共培養、生物材料包裹等，微載體的出現為肝細胞的大規模培養提供了新的思路，但微載體存在著大小規模不等、電荷性質不穩定、細胞黏附差，并且肝細胞結合微載體在體外大規模培養過程中仍容易受到氧氣營養物質供應不足、代謝產物蓄積等各種因素的損傷，從而導致肝細胞的活性及功能下降，最終因為細胞凋亡影響治療效果；并且如何把細胞從其已經生長的微載體轉到新的沒有細胞生產的微載體進行細胞放大，也是需要解決的問題。

因此，建立功能肝細胞結合微載體的大規模培養是臨床目前面臨的難題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服上述缺陷，設計、研制出一種能夠滿足臨床用細胞數量、細胞活性高、生物相容性好、高效的基于iPSC來源肝細胞的仿生微載體培養方法及應用。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案是：

一種iPSC來源肝細胞的仿生微球大規模培養的方法，利用微流控技術制備GelMA細胞微載體，在其表面包裹Bcl-2重組蛋白以增強特異性抗凋亡活性，在鏡下觀察其形態，將包裹Bcl-2重組蛋白的GelMA細胞微載體與iPSC來源肝細胞相結合，根據不同直徑細胞微載體的細胞粘附情況篩選最優尺寸，大規模培養后經光鏡、透射電鏡觀察細胞三維結構，檢測細胞微載體上iPSC來源肝細胞活性及功能表達。

進一步的，采用圓柱形微載體大規模培養瓶進行細胞結合微載體培養，置于搖床上，采用旋轉蹺蹺板式培養，搖速11rpm，角度4度，使得細胞與微載體在底層充分接觸。

進一步的，所述的圓柱形微載體大規模培養瓶頂部具有微載體注入口，微載體注入口連接微載體注入管，圓柱形微載體大規模培養瓶的內部分為上、下兩部分培養層，上培養層的具有中心旋轉柱，所述中心旋轉柱下端連接轉盤，所述轉盤上具有開口，轉盤置于具有對應開口的隔層上，將轉盤開口與隔層開口對齊時開口打開，連通上培養層和下培養層，構成旋轉打開裝置。

進一步的，所述的微載體注入管與中心旋轉柱為一體連接結構，上部通過圓柱形微載體大規模培養瓶上的微載體注入口伸出培養瓶瓶體，下部安裝在上培養層底部的的轉盤中心。

進一步的，在下培養層在培養瓶壁上設有進液口、出液口和取樣口；所述進液口處設有0.22um的斜角濾過膜，用于濾過雜質。

所述的圓柱形微載體大規模培養瓶底部為硅橡膠薄膜氣體交換膜，有利于細胞與外界的氣體交換。