[發明專利]提高牛體外受精效率的方法和所用的凍存液和解凍液

有效

• 申請號: 202110494596.5
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN113151160B
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 王娜;王小武;韓勇權;郝少強;趙明禮;郭春明;許曉椿
• 申請（專利權）人: 天津力牧生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076;C12N5/075;C12N5/073;A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.牛體外受精胚胎培養的方法，其包括如下步驟：

(1)卵母細胞的采集和體外成熟

a)離體采集：取屠宰場所得牛卵巢，抽取表面2-8mm的卵泡，收集沉淀，在體視顯微鏡下撿出至少含有3層卵丘細胞包裹的卵母細胞COCs即卵丘-卵母細胞復合體，放入包含HEPES的運輸培養液中38.8℃、無二氧化碳供應、24h內運回實驗室；或

a)活體采集：取牛活體采卵來源的卵泡液，在體視顯微鏡下撿出至少含3層卵丘細胞包裹的卵丘-卵母細胞復合體，放入包含HEPES的運輸培養液中38.8℃、無二氧化碳供應、24h內運回實驗室；

b)將以上離體采集或者活體采集所得COCs在卵母細胞成熟培養液中洗滌1次，再轉移到新的成熟培養液中培養22-24h，培養條件為38.8℃、5.5-6.5% CO2、飽和濕度；

(2)體外受精

將成熟的COCs在受精培養液中洗滌1次，再轉移到受精培養液中，放入培養箱中，備用；

從液氮中取一支凍精細管，37℃水浴解凍；無菌操作剪開細管兩端，使精液注入盛有精液制備培養液的15mL離心管中，328×g離心2次，每次5min，離心后棄上清；將300μL精液制備培養液加入上述離心管，重懸精子沉淀，取適當的精子懸液進行精子計數；

將計算好體積的精子懸液加入盛有卵母細胞的受精培養液滴中，并將培養盤放入培養箱，使精卵共孵育16-20h，培養條件為38.8℃、5.5-6.5% CO2、飽和濕度；

(3)胚胎體外培養、保存和解凍

體外受精操作完畢后，將胚胎周圍的顆粒細胞用剝卵針去除干凈，放入胚胎培養液中培養，此時記為胚胎培養的第1天，培養條件為38.8℃、6% O2、88% N2、飽和濕度，第3天記錄卵裂率；第7天記錄囊胚率，至第9天時統計囊胚孵化率，并進行質量鑒定；

將可用胚胎在保存液中洗滌3次，在平衡液中平衡10min后轉移入冷凍液，按5段裝液法裝入胚胎，做好標記，再放入程序降溫儀中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后，將胚胎細管迅速取出，置入液氮中冷凍保存；所述冷凍液的組成為：PBS+20%FBS+1.8mol/L乙二醇+0.25mol/L蔗糖+0.2%~0.3%右旋糖酐20或右旋糖酐40+5mmol/L乙酰半胱氨酸；

在需要使用冷凍保存的胚胎時，從液氮中取出細管，在空氣中停留5s，放入37°C水浴中，待冰晶全部融化為止，剪開細管，將胚胎迅速移入解凍液中，室溫下保持5min，然后將胚胎放入胚胎培養液小滴內培養，完成解凍過程；所述解凍液的組成為：PBS+20%FBS+0.25mol/L蔗糖+0.2%~0.3%右旋糖酐20或右旋糖酐40+5mmol/L乙酰半胱氨酸。

2.根據權利要求1的方法，其中步驟(3)中，所述冷凍液的組成為：PBS+20%FBS+1.8mol/L乙二醇+0.25mol/L蔗糖+ 0.2%右旋糖酐40或者0.3%右旋糖酐20+5mmol/L乙酰半胱氨酸。

3.根據權利要求1的方法，其中步驟(3)中，所述解凍液的組成為：PBS+20%FBS+0.25mol/L蔗糖+0.2%右旋糖酐40或者0.3%右旋糖酐20+5mmol/L乙酰半胱氨酸。

4.根據權利要求1的方法，所述PBS即磷酸鹽緩沖液的pH值為7.0且是照如下方式配制的：取磷酸氫二鉀9.39g與磷酸二氫鉀3.5g，加水使成1000ml，濾過，在115℃滅菌30分鐘。