[發(fā)明專利]一種檢測(cè)疾病核酸標(biāo)志物的SPR-SERS雙模傳感器、其制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110494110.8
• 申請(qǐng)日: 2021-05-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113293197B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張晶晶;蔣新宇;李雪;宋春元;汪聯(lián)輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京郵電大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6825
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6825;C12Q1/6886;G01N21/65;G01N21/59;G01N21/49
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 曹翠珍

1.一種檢測(cè)疾病核酸標(biāo)志物的SPR-SERS雙模傳感器，其特征在于，所述雙模傳感器包括第一試劑、第二試劑和第三試劑；

所述第一試劑為檢測(cè)探針Probe?1，所述檢測(cè)探針Probe?1為表面修飾捕獲單鏈C的金納米顆粒；

所述第二試劑為修飾有染料分子的發(fā)夾型DNA單鏈H2；

所述第三試劑為檢測(cè)探針Probe?2；所述檢測(cè)探針Probe?2為表面修飾有能識(shí)別目標(biāo)核酸的發(fā)夾型DNA單鏈H1和內(nèi)標(biāo)拉曼分子4-MBA的金納米顆粒；

所述捕獲單鏈C堿基序列如SEQ?ID?NO：2所示：5’-SH-(CH₂)₆-TTT?TTA?ACA?CAA?ACATC-3’；

所述發(fā)夾型DNA單鏈H1的堿基序列如SEQ?ID?NO：3所示，5’-ACA?CAA?CCC?TAG?TGG?CGCCAT?TGA?TGT?TTG?TGT?GAA?TGG?CGC?CAC?TAG?GGT?TTT?T-(CH₂)₆-SH-3’；

所述發(fā)夾型DNA單鏈H2的堿基序列如SEQ?ID?NO：4所示；5’-ROX-GCC?ATT?CAC?ACA?AACATC?AAT?GGC?GCC?ACT?AGG?GTT?GTG?TCG?CCA?TTG?ATG?TTT?GTG?TT-ROX-3’；

所述金納米顆粒（AuNP）粒徑為15~100?nm；

目標(biāo)miRNA-652的核酸堿基序列為：5’-AAT?GGC?GCC?ACT?AGG?GTT?GTG?T-3’；

針對(duì)目標(biāo)miRNA-652堿基序列的特異性實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的單堿基錯(cuò)配序列（SM），三堿基錯(cuò)配序列（TM），完全錯(cuò)配（UM）堿基序列為：

單堿基錯(cuò)配序列（SM）：5’-AAT?GGC?GCC?ACT?AGG?GTT?GAG?T-3’；

三堿基錯(cuò)配序列（TM）：5’-AAA?GGC?GCC?ACA?AGG?GTT?GAG?T-3’；

完全錯(cuò)配（UM）：5’-TAG?CTT?ATC?AGA?CTG?ATG?TTG?A-3’。

2.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)疾病核酸標(biāo)志物的SPR-SERS雙模傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下：

1）第一試劑的制備：

首先離心清洗AuNPs并使用超純水重分散；

其次，將捕獲單鏈C與TCEP溶液混合置于恒溫混勻儀中過(guò)夜反應(yīng)以還原巰基之間形成的二硫鍵；

隨后將捕獲單鏈C與AuNPs混合并共培養(yǎng)，捕獲單鏈C通過(guò)巰基與金形成共價(jià)鍵修飾在AuNPs表面；

之后加鹽老化，提純?nèi)コ锨逡海玫浇K產(chǎn)物AuNP-C檢測(cè)探針Probe?1，即為第一試劑；

2）第二試劑的制備：根據(jù)發(fā)夾型DNA單鏈H1設(shè)計(jì)并合成修飾有染料分子的發(fā)夾型DNA單鏈H2，即為第二試劑；

3）第三試劑的制備：首先，將發(fā)夾型DNA單鏈H1與TCEP溶液混合置于恒溫混勻儀中過(guò)夜反應(yīng)以還原巰基之間形成的二硫鍵；其次，將發(fā)夾型DNA單鏈H1與AuNPs混合并共培養(yǎng)過(guò)夜，然后加鹽老化；隨后，加入內(nèi)標(biāo)拉曼分子4-MBA共培養(yǎng)；最后，提純?nèi)コ锨逡海玫阶罱K產(chǎn)物AuNP-H1@4-MBA檢測(cè)探針Probe?2，即為第三試劑；

4）SPR-SERS雙模傳感器的制備：

在檢測(cè)疾病核酸標(biāo)志物存在下，第三試劑上的H1被該核酸標(biāo)志物觸發(fā)打開(kāi)，形成T-H1雙鏈；

借助第二試劑，即染料分子標(biāo)記的發(fā)夾型DNA單鏈H2，觸發(fā)T-H1雙鏈發(fā)生催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)，在檢測(cè)探針Probe?2表面形成多個(gè)染料分子標(biāo)記的H1-H2雙鏈，同時(shí)伴隨疾病核酸標(biāo)志物的釋放，供循環(huán)使用；

在上述溶液中同時(shí)加入第一試劑和第二試劑后，第一試劑上的捕獲單鏈C與H1-H2雙鏈的粘性末端雜交，形成Probe?1-Probe?2網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，Probe?1-Probe?2網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致了DFM圖的顏色變化和SERS信號(hào)增強(qiáng)；通過(guò)暗場(chǎng)顯微鏡觀察到Probe?1-Probe?2網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在ITO玻璃上散射黃光或紅光的DFM圖；同時(shí)，SERS檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)Probe?1-Probe?2網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中豐富的納米間隙顯著增強(qiáng)的染料分子?ROX和內(nèi)標(biāo)拉曼分子4-MBA的SERS信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)。