[發明專利]一種牛傳染性鼻氣管炎病毒的檢測方法

在審

• 申請號: 202110492607.6
• 申請日: 2021-05-07
• 公開（公告）號: CN112981010A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發明（設計）人: 姚剛;付強;任強林;馬義誠;張楊;馬雪連;蘇戰強;陳卓;夏瑞陽;李鑫;李紫仟;金肖葉;郭雪萍
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 烏魯木齊博亞思知識產權代理事務所(普通合伙) 65110
• 代理人: 王志剛

本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一種牛傳染性鼻氣管炎病毒的檢測方法，其中包括特異性目標序列，如SEQ ID NO.1所示，試劑盒包括熒光定量PCR檢測引物對和探針，引物對如SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3所示；探針的序列如SEQ ID NO.4所示的。本發明設計的用于檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的TaqMan探針熒光定量PCR試劑盒具有很高的特異性和靈敏性，能夠用于篩選各臨床樣品檢測牛傳染性鼻氣管炎陽性樣本，具有檢測時間短，檢測靈敏度高，穩定性高的特點。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別是涉及一種牛傳染性鼻氣管炎病毒的檢測方法。

背景技術

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)又叫“壞死性鼻炎”、“紅鼻病”，該病是由牛皰疹病毒Ⅰ型(Bovine herpes virus type 1，BHV-1)引起的一種急性、熱性接觸性傳染病，會引起牛嚴重的呼吸道感染，并有時會出現結膜炎、腦炎、產奶量減少、子宮炎、腸炎、傳染性膿皰性外陰陰道炎等癥狀。病毒可以在宿主的整個生命周期中保持潛伏狀態，這種病毒是自我重新激活型的，可通過壓力和皮質類固醇治療重新激活，導致復發，造成環境中病毒和傳播的永久化，嚴重影響動物健康和生產力，因流產、死亡、屠宰需求和產奶量下降而給養牛業帶來重大經濟損失。傳統的病毒分離技術用時較長，且有一定的技術要求，傳統PCR檢測存在一定誤差準確性不高，血清學抗體檢測陰性的牛也有可能是病毒攜者，因此，建立一種靈敏、穩定、快速的IBRV檢測方法對于準確篩查患畜、有效控制IBR的傳播至關重要。

發明內容

本發明目的在于，提供一種利用IBRV截斷gB基因建立的牛傳染性鼻氣管炎病毒的TaqMan探針熒光定量PCR檢測方法，能夠高效、準確的檢測牛傳染性鼻氣管炎陽性樣本的檢測方法。

本發明的技術方案：一、一種用于檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的特異性目標片段，如SEQ ID NO.1所示，具體通過對NCBI數據庫中所有IBRV gB基因組DNA對比分析，選定同源性、抗原性、親水性和表面展示概率相對最強的部分，特異性目標片段的基因大小為79bp。

二、用于擴增上述特異性目標片段的特異性引物對及探針，所述特異性引物對的上游引物為5'CTACTACAAGCGCGA CATGG 3'，如SEQ ID NO.2所示，

下游引物為5'CACGTGCTGTGTACGC AAA 3'，如SEQ ID NO.3所示；

所述探針為5'HEX-ACCGGCTCCTTGAGGCGCCG-BHQ-1 3'，如SEQ ID NO.4所示，其中，5’端標記有熒光基團HEX，3’端標記有淬滅基團BHQ-1。

三、一種用于檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的TaqMan探針熒光定量PCR試劑盒，包含有上述的特異性引物對和探針。

四、使用上述的試劑盒的檢測步驟如下：

步驟1、提取待檢測樣品的總DNA；

步驟2、以上述DNA為模板，利用TaqMan探針熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量PCR擴增得到擴增曲線，其優化后的反應體系如下，總體系為20μL；

步驟3、對所述擴增曲線進行分析，并作出判斷。其中，所述步驟2中擴增的反應體系具體包括：權利要求2所述的特異性引物對和探針；2×PerfectStart^TMⅡProbe qPCRSuperMix；RNase-free waster；牛傳染性鼻氣管炎病毒標準陽性質粒；擴增程序為：94℃預變性30s；94℃變性5s；60℃退火和延伸30s，共40個循環。