[發明專利]一種基于刺猬狀磁性微球的外泌體富集方法

有效

• 申請號: 202110488909.6
• 申請日: 2021-04-29
• 公開（公告）號: CN113186166B
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 趙遠錦;楊文君;王月桐;余筠如;商珞然;張大淦
• 申請（專利權）人: 南京鼓樓醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 蔣廈

本發明公開了一種基于刺猬狀磁性微球的外泌體富集方法，該方法基于刺猬狀磁性微球，在其硅酸鎂殼層表面修飾CD63抗體來特異性捕獲外泌體，磁鐵收集得到富集外泌體的磁性微球，對捕獲到的外泌體裂解之后檢測其內容物。其特征在于刺猬狀磁性微球硅酸鎂外殼呈納米針狀結構，形似刺猬，表面可修飾更多CD63抗體結合外泌體；所述微球內核為磁性四氧化三鐵納米粒子，能夠在外加磁場的作用下迅速分離富集外泌體的磁性微球，從而進行下游檢測。這種基于刺猬狀磁性微球的外泌體富集方法具有特異性強、簡易高效、安全環保、可重復性高等優點。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種基于刺猬狀磁性微球的外泌體富集方法，該磁性微球捕獲外泌體可應用于腫瘤診斷、腫瘤治療等技術領域中。

背景技術

外泌體(Exosomes)是活細胞分泌的具有生物活性的雙層膜結構的小囊泡，直徑約30-150nm。它攜帶分泌細胞中含有的多種生物活性物質，如RNA(mRNA和microRNAs)、DNA片段、蛋白質和脂質。腫瘤細胞釋放的外泌體參與了腫瘤發生、發展的多個過程，包括腫瘤轉移及血管新生、腫瘤免疫逃逸等。這使外泌體有望成為識別早期腫瘤和監測治療反應的潛在癌癥生物標志物。

外泌體的提取方法多種多樣，目前常見的方法包括蔗糖密度梯度離心法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色譜法、超速離心法、免疫磁珠法等，其中磁珠富集是比較理想的方法。然而傳統的磁珠往往表面結構過于簡單，無法連接大量探針，與外泌體的結合效率仍不夠理想，阻礙了相關研究的進一步發展。因此新型的外泌體富集策略仍然有待開發。

基于二氧化硅包裹的磁性納米粒子制備的硅酸鎂核殼微球，表面可以形成納米針狀的結構，形似刺猬，比表面積大大增加，有更多結合位點。且形成過程中不影響內核的磁性，當施加磁場時，更易于分離富集到外泌體的刺猬狀磁性微球。因此，在本發明中，我們基于刺猬狀磁性微球，設計發明了一種外泌體的富集方法，可用于腫瘤診斷、腫瘤治療等技術領域中。

發明內容

為了解決傳統磁性微球表面結構簡單、制備較復雜、難以高效捕獲外泌體的缺點，本發明提供了一種基于刺猬狀磁性微球的外泌體富集方法。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案是：

一種基于刺猬狀磁性微球的外泌體富集方法，包括如下步驟：

(1)通過低溫超速離心的方法從HepG2細胞系的培養上清液中收集標準外泌體樣品，將得到的標準外泌體樣品用PBS重懸，儲存在4℃以供使用；

(2)刺猬狀磁性微球在3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES的作用下進行氨基修飾，再在丁二酸酐的作用下羧基化，配置EDC和NHS溶液活化微球表面的羧基；然后加入CD63抗體，置于恒溫混勻儀孵育，得到抗體標記的刺猬狀磁性微球；

(3)然后將上述抗體標記的刺猬狀磁性微球與標準外泌體樣品充分混合，在恒溫混勻儀中孵育，用磁鐵收集成功富集外泌體的刺猬狀磁性微球，使用PBS清洗；再通過免疫印跡WesternBlot檢測外泌體標志性蛋白的存在。

其中，標準外泌體樣品的收集通過以下步驟處理得到：

a)收集細胞培養液，300g離心10min，收集上清液；

b)將收集到的上清液2000g離心10min，收集上清液，0.22微米濾膜濾過；

c)收集0.22微米濾膜濾過的上清液，120000g離心70min，倒掉上清；

d)收集步驟c)的離心沉淀，使用PBS重懸，120000g離心70min，倒掉上清，再次用PBS重懸，得到標準外泌體樣品。

步驟(2)中使用的3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES使用乙醇溶液配置，使用的丁二酸酐為二甲基亞砜溶液配置。

步驟(2)中使用的EDC、NHS為pH 6的MES溶液配置所得。