[發明專利]一種高效的從河豚內臟提取和分離制備高純度河豚毒素的方法

有效

• 申請號: 202110487094.X
• 申請日: 2021-05-04
• 公開（公告）號: CN113321661B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 李海航;張琳琳;張文龍;曾俊美;儲智勇;錢曉明
• 申請（專利權）人: 中洋生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C07D491/22
• 分類號: C07D491/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開一種高效的從河豚內臟提取和分離制備高純度河豚毒素（tetrodotoxin,簡稱TTX）的方法；其包括以下步驟：將干凈的河豚內臟加酸性醇勻漿、加入一定量的助流動劑攪拌均勻后，按柱層析的裝柱方法將材料裝入層析柱中；用同一酸性醇將河豚內臟中的TTX完全洗脫出來，收集洗脫液為TTX提取液；提取液減壓濃縮至水相，得到TTX提取濃縮液；TTX水溶液用離子交換樹脂柱層析分離，收集含TTX高的洗脫液，用納濾膜濃縮或減壓蒸干，得到TTX粗品；TTX粗品通過溶劑沉淀和結晶，得到純度達于98%的TTX；本發明的制備TTX的方法和所用設備簡單，TTX提取和分離純化的得率高、制備成本低，適合TTX的規模化生產；同時該方法使用的有機溶劑可全部回收重復使用，無有害溶劑和廢棄物排放，是理想的安全環保的制備TTX方法。

技術領域

本發明涉及一種動物體內生物活性物質的提取和分離純化技術領域，尤其涉及河豚內臟中河豚素的制備方法。

背景技術

河豚毒素（Tetrodotoxin, TTX）最初是從河豚魚（pufferfish, Lagocephalus sceleratus）中提取的小分子非蛋白生物堿類強神經毒素。1909年，日本學者Tawara首次從河豚魚卵巢中提取出粗毒素并命名（Bane et al., 2014）1950年Yokoo首次從紅鰭東方豚卵巢中獲得純化的TTX 結晶(Yokoo, 1950)。1964年，TTX的分子式（C₁₁H₁₇N₃O₈）和化學結構得以確定(Buchwald et al., 1964; Woodward and Gougoutas, 1964; Tsuda and Ikumaet al., 1964)。在很長一段時間里，河豚毒素被認為是河豚魚體內特有的毒性物質，直到1964年，美國科學家Mosher等從加利福尼亞蠑螈 (Taricha torosa) 中分離得到TTX(Mosher et al., 1964)，才改變了這一說法。迄今的研究表明，TTX不僅存在于多種河豚魚體內，還廣泛存在于近140種動物中，包括脊椎動物和無脊椎動物(Lorentz et al.,1016)，如蝦虎魚(朱國萍等，2015)、蠑螈（Yotsu-Yamashita et al., 2012）、雙殼類和腹足類(Laura et al., 2019)、藍環章魚(Whitelaw et al., 2019)、紐蟲(Vlasenko et al.,2018)、線蟲(毛婕，等，2020)等. 而且已經發現多種微生物可產生TTX（Chau et al.，2011；Magarlamov et al. 2017）。

TTX是已知的毒性最強的神經毒素之一，它對人類的毒性是氰化物的1200倍左右，而且沒有已知的解毒劑（Lago et al.，2015）。TTX對小鼠的LD₅₀值為10 μg/kg（腹膜內）、16μg/kg（皮下）和332 μg/kg（口服)（Kao，1966）。人體攝入TTX后，中毒癥狀的嚴重程度與劑量有關（Homaira et al.，2010）。最初癥狀包括舌頭和嘴唇發麻（感覺異常），然后出現頭痛或嘔吐，并可能發展為肌肉無力和共濟失調。在嚴重的情況下，可能由于呼吸或心力衰竭而導致死亡（Noguchi and Eebesu，2001）。TTX對人的致死劑量是1.33μg/kg（Kasteel andwesterink，2017）。TTX通過生物鏈傳遞和大量海洋與淡水養殖動物中含有TTX等問題，導致人們對環境的安全的憂慮和重視。