[發(fā)明專(zhuān)利]一種在肌源性細(xì)胞特異性高表達(dá)SIA的重組表達(dá)載體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110483409.3
• 申請(qǐng)日: 2021-04-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113215195B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王剛;鄧璐;謝麗芳;盧宛翎;李彩俠;劉明
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川大學(xué);中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/85
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/85;C12N15/17;C12N15/66;A61K38/28;A61P3/10
• 代理公司: 成都東恒知盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 51304
• 代理人: 羅江

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在肌源性細(xì)胞特異性高表達(dá)SIA的重組表達(dá)載體及其應(yīng)用。所述重組表達(dá)載體啟動(dòng)子為Psubgt;EMS/subgt;，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；編碼SIA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明使用柔性肽(GGGGS)3替代C肽對(duì)胰島素原進(jìn)行改造，獲得了高活性單鏈胰島素類(lèi)似物SIA，采用增強(qiáng)型肌肉特異性啟動(dòng)子Psubgt;EMS/subgt;調(diào)控SIA的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了高活性單鏈胰島素類(lèi)似物SIA在骨骼肌細(xì)胞中特異性高效表達(dá)并分泌出胞外進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，既可以達(dá)到有效降血糖的效果，又同時(shí)避免異位表達(dá)產(chǎn)生不必要的副作用。本發(fā)明所述重組表達(dá)載體可用于制備治療I型糖尿病的藥物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在肌源性細(xì)胞特異性高表達(dá)SIA的重組表達(dá)載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

糖尿病是由于機(jī)體對(duì)葡萄糖代謝產(chǎn)生紊亂而導(dǎo)致體內(nèi)血糖水平較高的一類(lèi)疾病，受遺傳因素和環(huán)境因素影響較大。隨著社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和進(jìn)步，人們的生活方式和飲食習(xí)慣發(fā)生了較大變化，導(dǎo)致全球糖尿病患者的人數(shù)在逐漸增加。糖尿病通常分為1型和2型糖尿病。1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，通常在青少年時(shí)期發(fā)病，其發(fā)病機(jī)理主要是胰島β細(xì)胞成分被免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤識(shí)別為抗原而受到了破壞，使得體內(nèi)胰島素絕對(duì)缺乏，進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖代謝失調(diào)和血糖升高。

胰島素是目前治療1型糖尿病唯一有效藥物，但長(zhǎng)期的皮下注射容易造成疼痛、皮膚感染和皮下淤血等，并且由于促進(jìn)脂肪合成，容易造成患者體重增加；另一方面，1型糖尿病患者的血糖譜呈波動(dòng)大的特點(diǎn)，原因在于患者獨(dú)立注射胰島素時(shí)難以準(zhǔn)確、靈活地調(diào)整劑量，容易引起波動(dòng)性高血糖和低血糖事件。為了解決這一問(wèn)題，目前有許多新的思路：1.胰島β細(xì)胞置換：人全胰腺或胰島移植、基因工程胰島素分泌細(xì)胞、生物人工胰腺；2.自動(dòng)胰島素輸送裝置；3.體細(xì)胞基因治療；4.將胰島α細(xì)胞轉(zhuǎn)換為胰島β細(xì)胞，等等。

1型糖尿病人需要長(zhǎng)期、反復(fù)、高頻率(多數(shù)為每日一次)肌注胰島素，其療效確切但也給病人帶來(lái)不便和不適?；蛑委熛鄬?duì)于胰島移植、胰島細(xì)胞重編程等操作，具有操作簡(jiǎn)單、花費(fèi)較少、普適性高等多種優(yōu)勢(shì)。因此，1型糖尿病的有效基因治療一直是備受關(guān)注的重要研究方向。

基因治療是將目的基因片段經(jīng)過(guò)體外克隆、構(gòu)建表達(dá)載體后，再用特殊的傳遞方法將攜帶外源基因的表達(dá)載體傳遞到細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)完成目的蛋白的表達(dá)，在胞內(nèi)或胞外特定位點(diǎn)發(fā)揮應(yīng)有的生理作用，從而實(shí)現(xiàn)外源目的基因代替變異/缺失基因以實(shí)現(xiàn)功能恢復(fù)，以此達(dá)到疾病緩解和治療的目標(biāo)。

基因治療的體系主要有三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，分別包括(1)功能基因：根據(jù)疾病的發(fā)病機(jī)制選擇正確的目的基因作為治療基因。1型糖尿病的治療基因主要是胰島素基因。(2)基因傳遞：由于基因治療需要將外源表達(dá)載體傳遞到生物體內(nèi)，因此選擇最優(yōu)的基因傳遞系統(tǒng)是將外源基因高效導(dǎo)入生物體內(nèi)目標(biāo)位置的關(guān)鍵。(3)基因表達(dá)：在外源基因傳遞到靶組織、器官或靶細(xì)胞后，需要確保外源基因能在該部位特異性高效表達(dá)，即表達(dá)產(chǎn)物要達(dá)到足夠的量以產(chǎn)生有效生物學(xué)功能，同時(shí)還要避免異位表達(dá)產(chǎn)生不必要的副作用。

在生理?xiàng)l件下，胰島素基因轉(zhuǎn)錄、翻譯出的胰島素原(proinsulin)為含有B鏈、C肽和A鏈的一條單鏈前體肽，需要在胰島β細(xì)胞中經(jīng)過(guò)特定的酶切掉C肽，A、B鏈間通過(guò)兩條二硫鍵形成成熟胰島素，方能發(fā)揮生理作用。C肽結(jié)構(gòu)冗長(zhǎng)且剛性較大，影響胰島素活性的發(fā)揮，未切掉C肽的胰島素原的活性只有成熟胰島素的5％。將胰島素原中的C肽切除的體系為胰島β細(xì)胞所獨(dú)有，這意味著當(dāng)外源胰島素基因試圖在非胰島β細(xì)胞(如肝臟和肌肉組織)中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，將很難得到高活性的成熟胰島素。

因此，目前有必要探究一種更為有效的用于治療糖尿病的分子工具。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種在肌源性細(xì)胞特異性高表達(dá)SIA的重組表達(dá)載體及其應(yīng)用，所述重組表達(dá)體在骨骼肌部位特異性高效表達(dá)，一方面表達(dá)足量的SIA可產(chǎn)生有效降低血糖的效果；另一方面可避免異位表達(dá)產(chǎn)生不必要的副作用。