[發明專利]改變細胞內基因組序列的方法、基因編輯細胞及應用

在審

• 申請號: 202110481333.0
• 申請日: 2021-04-30
• 公開（公告）號: CN113512535A
• 公開（公告）日: 2021-10-19
• 發明（設計）人: 吳宇軒
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N9/22;C12N15/113;A61K35/28;A61P7/06
• 代理公司: 上海翰信知識產權代理事務所(普通合伙) 31270
• 代理人: 張維東

本發明提供了一種改變細胞內基因組序列的方法、基因編輯細胞及應用，將短的DNA片段插入特定DNA區域，改變靶標DNA序列，此方法可以被應用于基因修復和基因治療。例如，用于造血干細胞HBB基因修復，利用基因編輯技術靶向修復β?地中海貧血41/42(?TCTT)型突變，通過設計并合成能識別引導核酸酶至目標基因靶序列的sgRNA，將其與核酸酶混合引入β?地貧密碼子41/42(?TCTT)造血干細胞中，同時引入缺失的41/42(?TCTT)雙鏈片段高效修復該突變位點的移碼突變，恢復蛋白基因的正常表達。本發明修復效率高，修復后的患者造血干細胞在自體移植后可以重建患者血液系統并治療地中海貧血疾病。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種改變細胞內基因組序列的方法、基因編輯細胞及應用。

背景技術

近年細菌和古細菌中一種用來抵御噬菌體和質粒等外源DNA片段入侵的獲得性免疫機制得到了闡釋。該系統由Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats(CRISPR)和CRISPR-associated(CAS)基因組成。CRISPR系統的免疫干擾過程主要包括3個階段：適應、表達和干擾。適應階段，CRISPR系統會將來自噬菌體或質粒的DNA短片段整合到前導序列和第一段重復序列之間，每一次整合都伴隨著重復序列的復制，進而形成一個新的重復-間隔序列單元。表達階段，CRISPR基因座會被轉錄成一段CRISPR RNA(crRNA)前體(pre-crRNA)，該前體在Cas蛋白和反式編碼小RNA(trans-encoded smallRNA，tracrRNA)的存在下會在重復序列處被進一步加工成小的crRNA。成熟的crRNA與Cas蛋白形成Cas/crRNA復合體。干擾階段，crRNA通過其與靶序列互補的區域引導Cas/crRNA復合體尋找靶點，并在靶點位置通過Cas蛋白的核酸酶活性造成靶點位置的雙鏈DNA斷裂，從而使靶標DNA失去原有功能。其中與靶點3′端緊鄰的3個堿基必須是5′-NGG-3′的形式，從而構成Cas/crRNA復合體識別靶點所需的PAM(protospacer adjacent motif)結構。

CRISPR系統分為I，II，III型三個家族，其中II型系統僅需要Cas9蛋白即可在tracrRNA的協助下將pre-crRNA加工成與tracrRNA結合的成熟crRNA。人們發現通過人工構建模擬crRNA：tracrRNA復合體的單鏈嵌合體引導RNA(guide RNA，又稱sgRNA)，即可有效的介導Cas9蛋白對靶點的識別和切割，從而為在目標物種中利用CRISPR系統對目標DNA進行修飾提供了廣闊的前景。

β-地中海貧血是一種常見的由于β-珠蛋白基因(HBB基因)缺陷導致成人血紅蛋白異常的遺傳性疾病，我國“地貧”基因攜帶者約3000萬人，涉及近3000萬家庭、1億人口，重型和中間型“地貧”患者約30萬人。其中，密碼子(Codon)41/42(-TCTT)基因型是我國“地貧”中最為多見的一種，發病機制為HBB基因密碼子41/42(-TCTT)移碼突變造成氨基酸編碼異常并形成終止密碼子導致蛋白翻譯的提前終止，使得HBB基因的功能喪失。目前，中間型和重型患者需要長期輸血和去鐵治療來維持生命，唯一根治方式為異體造血干胞移細植術，但主要實施障礙是我國血液資源的緊缺、異體造血干細胞配型困難及移植相關并發癥等。其中，利用慢病毒載體進行基因治療，表現出極大的潛力，但是半隨機的載體整合方式，具致癌風險。同時慢病毒中的表達元件在造血干細胞長期歸巢和自我更新的過程中會逐漸沉默，使得療效下降，極有可能無法達到終身治愈的目的。另外，臨床所需的高濃度、高質量的慢病毒對設備和技術的要求極高，成本很難降低。因此，并行的、更加安全、成本更低的臨床方案是非常有必要的。